استفاده از روش ساده استخراج اسید نوکلئیک به منظور تشخیص چند گونه ویروئید از دو رقم تجاری مرکبات به وسیله تکنیک RT- PCR

ویروئیدها دارای RNA تک رشته‌ای و کوچک‌اند (246 تا 401 نوکلئوتید). به همین دلیل کل ژنوم آن‌ها می‌تواند در یک واکنش RT-PCR تکثیر شود. این عوامل، علایم مشابه ویروس‌ها در گیاهان میزبان ایجاد می‌کنند. هدف از این تحقیق استاندارد سازی روش کم هزینه ردیابی ویروئیدهای مرکبات در ارقام تجاری بدون استفاده از کیت استخراج اسید نوکلئیک می‌باشد. بر این اساس ارزیابی آلودگی دو رقم از ارقام تجاری مرکبات شامل تامسون ناول روغنی و پوملو به ویروئیدهای مرکبات با استفاده از استخراج اسید نوکلئیک با روش SDS-Potacium acetate و تکنیک RT- PCR مورد مطالعه قرار گرفت. در این بررسی ابتدا پس از کشت گیاهچه‌های بذری راف لمون در خاک استریل، رقم بالنگ اتراگ (Etrog citron) روی این گیاهان پیوند شد. عملیات آلوده‌سازی نهال ها، با اینوکولوم از منشا درختان مادری تامسون ناول روغنی و پوملو انجام شد. شش ماه پس از آلوده‌سازی، از آن ها نمونه برداری و عصاره گیری شد. بدین صورت که نمونه‌های بافتی (500 میلی گرم) در پاکت‌های پلاستیکی به همراه بافر استخراج (Mmercaptoethano10.5., mMEDTA 50, 8.0 PH, HCl ) یکنواخت شد. عصاره استخراج شده با SDS (20 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی‌گراد) و سپس با استات پتاسیم (20 دقیقه در یخ) تیمار شد. بخش قابل حل به وسیله رسوب اتانول تغلیظ شده و در40 میکرولیتر آب مقطر حل شد. آزمون واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با نسخه برداری معکوس (RT-PCR) با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ویروئیدهای HSVd، CBLVd، CDVd و CBCVd انجام و نتایج در ژل آگاروز 1% مشاهده شد. این تحقیق وجود ویروئیدهای HSVd، CBLVd،CDVd و CBCVd را در تامسون ناول روغنی اثبات کرد و نشان داد که تامسون ناول روغنی بر خلاف پوملو به این چهار نوع ویروئید آلوده می‌باشد. همچنین روش استخراج کم هزینه SDS-Potacium acetate می‌تواند در امر ردیابی ویروئیدهای مرکبات مورد استفاده قرار گیرد.

کلیدواژه ها:

ویروئید ، تامسون ناول روغنی ، پوملو ، RT-PCR ، SDS- Potacium acetate