کلون و بیان پروتئین نوترکیب NS5B هپاتیتC و ارزیابی فعالیت ایمنی این آنتی ژن

هپاتیت c مهمترین علت عفونت‌های کبدی در جهان است. روش‌های رایج جهت تشخیص و درمان این بیماری در بسیاری از موارد حساسیت و اختصاصیت لازم را ندارند و حتی دارای عوارض جانبی نیز هستند. پروتئین غیرساختاری 5B( NS5B ) در HCV یک انزیم کلیدی و دارای نقش RNA پلیمرازی وابسته به RNA است که در روند تکثیر ویروس نقش مهمی را بر عهده دارد. هدف این پژوهش جداسازی و کلونینگ دمین های ایمنولوژیک NS5B در وکتور PET102/D.TOPO و سپس بیان این پلی پپتید در باکتری E.coli است. ژنوم ویروس از سرم فرد مبتلا به هپاتیت C جداسازی و سپس cDNA مربوط به ناحیه ایمنولوژیک NS5B با استفاده از روش RT-PCR تهیه شد. قطعه‌ی هدف با روش nested-PCR تکثیر شده و بطور مستقیم در وکتور بیانی pET102/D.TOPO کلون شد و در سویه BL21 باکتری E.coli ترانسفورم گردید. سپس باکتری‌های ترانسفورم شده با استفاده از isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)1mM القا شدند و در نهایت برای تشخیص بیان پروتئین فیوژن نوترکیب از روش SDS-PAGE و وسترن بلات استفاده شد. تکثیر توالی مربوط به دمین های ایمنولوژیک پروتئین NS5B با استفاده از روش PCR و تعیین توالی (Sequencing) تایید شد. بیان این پروتئین نوترکیب با استفاده از آنتی بادی منوکلونال (Anti-His Tag) با روش وسترن بلاتینگ نشان داده شد. بیان قطعه پروتئینی مربوط به دمین‌های خطیNS5B در وکتور بیانی pET102/D.TOPO بطور موفقیت آمیز انجام گردید. این پروتئین نوترکیب می تواند به عنوان یک منبع مفید آنتی ژنی در مطالعات بعدی، طراحی داروهای ضد HCV و کیت‌های تشخیصی مورد استفاده قرار بگیرد.

کلیدواژه ها:

هپاتیت C ، NS5B ، پروتئین نوترکیب