کلون کردن قطعه اتصالی m۲e آنفلوانزا- ctxB ویبریو کلرا در پلاسمید pET۲۸a

سابقه و هدف: از آنجا که دومین خارجی پروتئین ماتریکس آنفلونزا ایمونوژن ضعیفی است انتخاب مناسبی جهت تولید واکسن نمی باشد. زیرواحد B انتروتوکسین وبا بخش غیر سمی و موجب اتصال هولوتوکسین به GM۱ موجود در سطح سلول های اپیتلیال روده می شود. CTB به شدت ایمونوژن می باشد. از اینرو اتصال این دو ژن کاربرد زیادی در تهیه واکسن نوترکیب آنفلونزا خواهد داشت. مواد و روش ها: از طریق PCR و با استفاده از پرایمر های اختصاصی حاوی جایگاه برش آنزیم محدود کننده ژن ctxB تکثیر شد. سویه استاندارد آنفلونزا نوع A ( A/ PUERTO RICO /۸/۳۴ ) تهیه و ژن M۲e از طریق RT-PCR و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی حاوی جایگاه برش تکثیر گردید. جهت اتصال دو ژن ctxB و M۲e واکنش PCR دوم به وسیله پرایمر R ژن ctxB و پرایمر F ژن M۲e انجام گرفت. محصول PCR با استفاده از آنزیم های BamH۱ و EcoR۱ هضم و در وکتور pET۲۸a کلون گردید. تائید کلونینگ با استفاده تعیین توالی صورت گرفت. پس از تائید، وکتور نوترکیب pET۲۸a/M۲e-ctxB در باکتری E.coli سویه Top۱۰ ترانسفورم گردید. تائید نهایی فیوژن، کلونینگ و ترانسفورمیشن از طریق PCR کلنی، هضم آنزیمی و تعیین توالی صورت گرفت. یافته ها: آنالیز توالی نشان داد ژن M۲e در فریم مناسب به ژن ctxB متصل شده بود. علاوه بر این ژن حاصل در محل برش آنزیم های BamH۱ و EcoR۱ در وکتور pET۲۸a کلون گردیده بود. نتیجه گیری: از آنجا که توالی ژن M۲e آنفلونزا دچار تغییرات آنتی ژنیک سالیانه نمی شود کاندید مناسبی جهت تولید واکسن آنفلونزا می باشد.با توجه به اینکه M۲e ایمونوژن بسیار ضعیفی می باشد فیوژن آن با ایمونوژن های قوی مانند CTB می تواند روشی نوین در تهیه واکسن نوترکیب آنفلونزا باشد.

کلیدواژه ها:

Matrix protein ۲ ، Influenza ، Recombinant vaccines ، Cholera toxin B subunit ، Fusion ، پروتئین ماتریکس ۲ ، آنفلونزا ، واکسن نوترکیب ، زیر واحد B توکسین وبا ، فیوژن