بهبود و توسعه میزان بیان ، حلالیت و تسهیل تخلیص آنزیم نوترکیب پروتئاز (rPR) ویروس HIV با روش TOPO-Cloning در باکتری BL۲۱ E.coli

سابقه و هدف : پروتئاز HIV نقش مهمی در بلوغ ویروس و تحریک پاسخ ایمنی میزبان دارد. به همین دلیل می­تواند هم به عنوان یک هدف درمانی و هم در تست های تشخیصی کاربرد داشته باشد. در مطالعات قبلی، تولید rPR با مشکلاتی مثل سمیت، آبگریز بودن و تخلیص روبرو بوده است. هدف از این مطالعه، استفاده از سیستم بیانی pET۱۰۲/D.TOPO برای غلبه بر مشکلات اشاره شده بود. مواد و روش ها: پس از جداسازی ژن پروتئاز از ژنوم HIV، فرایند کلونینگ با استفاده از سیستم TOPO Cloning در وکتور بیانی pET۱۰۲/D.TOPO انجام شد. بعد از القای بیان ژن با IPTG، پروتئین تولید شده با  استفاده از روش کروماتوگرافی حاوی ستون Ni-NTA تخلیص شد و غلظت آن با استفاده از کیت بررسی پروتئین BCA سنجیده شد. تولید پروتئین نوترکیب با SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ بررسی شد. یافته­ ها : کلونینگ ژن پروتئازHIV-۱  با استفاده از سیستم  کلونینگ  TOPO در وکتور بیانی pET۱۰۲/D بوسیله PCR با موفقیت صورت گرفت و با  sequencing تایید شد. غلظت rPR پس از تخلیص بین ۶۰ تا ۸۵ میکروگرم در میلی لیتر بود. بیان و تولید rPR به شکل محلول، با موفقیت انجام شد. و  با SDS-PAGE و وسترن بلات تایید شد. بحث و نتیجه گیری : در سیستم کلون سازی مورد استفاده به دلیل بیان rPR به صورت فیوز شده با تیوردوکسین و دارای برچسپ­های هیستیدینی، مشکل سمیت،آبگریز بودن و تخلیص تا حد زیادی برطرف شد. با توجه به میزان rPR تولید شده، می­توان از آن در تست های تشخیصی و جهت بررسی و طراحی مهارکننده های پروتئاز در مطالعات بعدی استفاده کرد.

کلیدواژه ها:

Human Immunodeficiency Virus ، TOPO Cloning ، protease ، recombinant protein ، HIV ، کلون سازی مولکولی ، پروتئاز ، پروتئین نوترکیب