استخراج آلکالوئید هلیوترین و سمیت زدایی توسط آنزیم باکتریایی اکسیدوردوکتاز وابسته به FAD

آلکالوئیدها متابولیتهای ثانویه گیاهی و سموم تولید شده توسط گیاهان هستند. آلکالوئیدهای پیرولیزیدینی هپاتوکسیک به عنوان یکی از عوامل مهم بیماری انسان از اهمیت بسیاری در شیوع مسمومیتهای کبدی برخوردارند. سم زدایی از این طیف گسترده سموم معمولا توسط تعداد محدودی از آنزیمها در کبد انجام میشود. هلیوترین یکی از آلکالوئیدهای با سمیت بالا دردمنوش گل گاوزبان گونه Echium amoenum است. به سبب استفاده گسترده ایرانیان از این دمنوش، دراین مطالعه تجزیه و سمیتزدایی هلیوترین مورد بررسی قرار گرفت. جهت استخراج عصاره آلکالوئیدی گلها در دمای ۶۰ درجه با حلال متانول در سوکسله قرار داده شد. حذف ناخالصی ها با حلالهای دی اتیل اتر و اتیل استات و جهت ته نشین شدن مواد رزینی نمک Nacl و در نهایت جهت حلالیت وتغییر فاز حلال کلروفرم استفاده شد. تخلیص و جداسازی آلکالوئید هلیوترین با استفاده از ستون سیلیکاژل و گرادیان غلظت متانول Bکلروفرم انجام شد. اکسیدوردوکتاز وابسته به FAD مشتق شده از سودوموناس آئروژینوزا ATCC ۲۷۸۵۳ که از نظر ساختاری مشابه FMO۳ انسانی بوده و در متابولیسم سموم در کبد موثر است برای اکسیداسیون هلیوترین استفاده شد. فعالیت آنزیمی Fmo۵p به صورت فوتومتری مورد سنجش قرار گرفت. واکنش در حجم کل ۲۰۰ میکرولیتر ، ۱-۰,۱ میکرولیتر غلظت نهایی آنزیم نوترکیب (پروتئینهای پلاسمایی) ، ۵۰ میلی مولار بافر Tris-HCl با pH=۸ و ۱۰۰ میکرومولار NADPH در ۲۵ درجه سانتیگراد انجام شد. این واکنش با کاهش جذب NADPH در ۳۴۰ نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر در گامهای ۳۰ثانیه تا توقف تغییرات دنبال شد. آزمایشهای شاهد بدون آنزیم تهیه شد. اختلاف جذب نور در ۳۴۰ نانومتر در ۵ دقیقه برای نمونه آزمایش ۰/۴۰۴ و برای واکنش کنترل ۰/۰۲۷ بدست آمد که تاییدی بر فعالیت اکسیداتیو آنزیم Fmo۵p برای سم زدایی از هلیوترین بود. این آنزیم قابلیت طراحی بعنوان دارو را دارد. در ادامه این مطالعه بررسی اثرات سم زدایی بر انواع دیگر آلکالوئیدهای پیرولیزیدینی پیشنهاد میشود.

کلیدواژه ها:

Echium amoenum ، اکسیدوردوکتاز وابسته به FAD ، هلیوترین ، پیرولیزیدین