همسانه سازی و بیان ژن پروتئین پوششی جدایه ایرانی ویروس موزائیک رگه ای نیشکر (SCSMV) در باکتری Escherichia coli

ویروس موزائیک رگه ای نیشکر (SCSMV) از عوامل مهم ایجادکننده بیماری موزائیک نیشکر در کشورهای آسیایی میباشد. مناسبترین راه برای کنترل آن استفاده از قلمه های عاری از ویروس است. بطور کلی ELISA روشی مناسب و مقرون به صرفه برای تشخیص ویروسها در مقیاس وسیع است، از اینرو تهیه آنتی بادی علیه SCSMV و حضور یا عدم حضور ویروس در قلمه های نیشکر حائز اهمیت است. با این وجود آنتی سرم تجاری برای تشخیص SCSMV در دسترس نیست. جهت تامین و آماده سازی آنتیژن ویروسی برای استفاده در فرآیند تولید آنتی بادی پلیکلونال، ژن پروتئین پوششی SCSMV با استفاده از آغازگرهای اختصاصی حاوی محلهای برشی BamHI و HindIII به ترتیب در انتهای ۵´ آغازگرهای مستقیم و معکوس در آزمون PCR تکثیر داده شد. محصول PCR پس از خالص سازی، به روش کلونسازی T/A در وکتور pTZ۵۷R/T الحاق شد. محصول الحاق، به درون سلولهای مستعد باکتری Escherichia coli سویه DH۵ منتقل شد. پس از کشت سلولهای باکتری ترانسفورم شده به مدت یک شب در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد، صحت همسانه نوترکیب حاصل (pTZ۵۷-SCSMV-CP) توسط هضم آنزیمی و انجام PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی مورد تایید قرار گرفت. ژن مربوطه پس از هضم آنزیمی با آنزیمهای برشی BamHI و HindIII از pTZ۵۷-SCSMV-CP بازیابی و در پلاسمید بیان pET۲۸a سابکلون گردید. پلاسمید نوترکیب حاصل (pET۲۸-SCSMV-CP) با روش شوک حرارتی به سلولهای باکتری E. coli سویه (DE۳) BL۲۱ وارد گردید و به مدت یک شب در محیط LB جامد حاوی g/ml ۲۵ آنتی بیوتیک کانامایسین کشت داده شد. وجود قطعه ی مورد نظر توسط هضم آنزیمی، PCR، و توالییابی تایید گردید. پس از اطمینان از صحت سازه pET۲۸-SCSMV-CP، بیان پروتئین پوششی ویروس با استفاده از غلظت ۱ میلی مولار IPTG القا گردید. نمونهبرداری در چهار ساعت پس از القا انجام و پروتئین کل استخراج شد. بیان پروتئین پوششی ویروس در باکتری E. coli با مشاهده باند حدود ۳۵ کیلودالتون در آزمون SDS-PAGE روی ژل جداکننده %۱۲ تایید گردید.

کلیدواژه ها:

آنتی بادی ، پروتئین پوششی ، همسانه سازی ، هضم آنزیمی ، ناقل بیانی