بهبود پایداری و حلالیت آنزیم اورنتین دکربوکسیلاز با استفاده از طراحی منطقی

پلی آمینها نقش مهمی در پالایش رادیکالهای آزاد دارند. اورنیتین دکربوکسیلاز آنزیم مهمی در بیوسنتز پوترسین است. استفاده از مهندسی پروتئین جهت بررسی امکان افزایش حلالیت و پایداری آنزیم در شرایط تنش خشکی به منظور حفظ فعالیت نرمال آنزیم، میتواند تاثیر بسزایی در ارتقای سطح مقاومت گیاه در شرایط تنش داشته باشد. به این منظور پیشگویی پایدارسازی ترمودینامیکی، اثرات جهشهای بالقوه بر روی پایداری دمایی آنزیم و نیز پیشبینی جهش های خطرناک به ازای هر آمینواسید با نرم افزار Dezyme و جستجوی سیستماتیک صورت پذیرفت و نقاط مستعد جهش شناسایی شدند. ۱۰ نقطه جهت جهش انتخاب و توسط سرور Dynamut به صورت تکی اعمال شدند. سپس جهش های ناپایدارکننده حذف شد و فقط جهشهای پایدارکننده K۳۴۹R)، D۲۳۳F، P۲۵۷Y، (P۴۱۲Y به صورت multiple point mutations اعمال شد. نتایج پایدارسازی ۲/۷۲۶ Kcal/mol بود. سپس بررسی نقاط مستعد تشکیل آمیلوئید و aggregation به ترتیب توسط سرورهای FoldAmyloid و AGGRESCAN۳D نشان داد، بیشترین آمینواسید درگیر در ایجاد آمیلوئید، لیزین و پس از آن والین و (ایزولوسین و تیروزین به میزان برابر) هستند.آنزیم موتانت با آمینواسیدهای لیزین کمتر، احتمال تشکیل آمیلوئید کمتری خواهد داشت. همچنین با استفاده از سرور Protpi|Protein Tool نقطه ایزوالکتریک پروتئین ۵/۹۰ و بار آن -۱۵/۷۹۲ اندازه گیری شد. نقطه ایزوالکتریک از pH سیتوزول سلول گیاهی (۷/۴)، فاصله دارد و احتمال رسوب آنزیم در این محیط کم است. سپس با استفاده از ابزار Supercharge tool در سرور Rosie و روش AVNAPSA و قراردادن هدف بار نهایی پروتئین برروی -۱۷ حلالیت آنزیم افزایش یافت و از فایل Pdb حاصل جهت استفاده در داکینگ به منظور بررسی اتصال آنزیم به کوفاکتور (PLP) استفاده شد. با نرم افزار chimera ساختار کوفاکتور بهینه شد و نتایج نهایی داکینگ بر آنزیم مهندسی شده به صورت ۱۰ کانفورماسیون اتصالی با مقادیر انرژیهای مشابه به دست آمد که حاکی از اتصال کوفاکتور به آنزیم در این کانفورماسیونها و عدم ایجاد اختلال در آن پس از جهش میباشد.

کلیدواژه ها:

پوترسین ، تنش ، آنزیم مهندسی شده ، داکینگ ، نقطه ایزوالکتریک