طراحی و ساخت زیست حسگر الکتروشیمیایی مبتنی بر فتوپروتئین آکوئورین به منظور رصد یون کلسیم

یون کلسیم در مسیرهای انتقال پیام، انقباض ماهیچه، فرایند لقاح، آپوپتوز، متابولیسم سلولی و انعقاد خون نقش داشته و برای برخی از آنزیمها بهعنوان کوفاکتور عمل میکند. با توجه به اهمیت این یون، رصد و دنبال کردن تغییرات غلظت و جریان آن در سلول و مایعات بیولوژیکی میتواند درک درستی از فیزیولوژی و عملکرد سلول در پاسخ به عوامل مختلف را ارائه دهد، همچنین در صنعت و مهندسی آب اندازه گیری یون کلسیم بسیار حائز اهمیت میباشد زیرا یکی از شاخص های سختی آب یون کلسیم می باشد. ازاینرو از روشهای مختلفی برای اندازهگیری کلسیم ازجمله روش رنگ سنجی، استفاده از پروب اختصاصی فلورسانس، نشر بیولومینسانس فتوپروتئینهای وابسته به کلسیم و الکترود حساس به کلسیم (calcium ion-selective electrode) استفاده میشود. با توجه به اینکه فتوپروتئین آکوئورین در ساختار خود دارای 4 موتیف EF-hand میباشد که 3 تا از آنها جایگاه اتصال اختصاصی به یون کلسیم را فراهم می نمایند، Bioreceptor کلسیم در بیوسنسور موردمطالعه ما میباشد. در این پژوهش توالی کدکننده فتوپروتئین آکوئورین در pET28a که از قبل کلون شده بود به روش شیمیایی به میزبان E. coli سویه BL21 (DE3) انتقال داده شد و بیان پروتئین با القای IPTG صورت گرفت و با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی نیکل خالصسازی و سپس دیالیز در غظت بهینه EDTA انجام شد. به منظور ساخت بیوسنسور الکتروشیمیایی، الکترود طلا به روش شیمیایی و اعمال ولتامتری چرخهای تمیز شد. سپس به منظور تشکیل self-assemble monolayer (SAM) از (MUA/MPA) مرکاپتوپروپیونیک اسید/مرکاپتودکانوئیک اسید با نسبت حجمی((7,3 استفاده شد. برای فعال کردن گروه های کربوکسیلیک اسید مرحلهی قبل از واکنش(EDC/NHS) دی متیل آمینو پروپیل n اتیل کربودی آمیدn/هیدروکسی سوکسینیمید به ترتیب با غلظتهای 0,4 و 0,1 مولار به مدت 1 ساعت استفاده شد و در ادامه مرحله تثبیت فتوپروتئین بر روی سطح الکترود صورت گرفت. برای پوشش و انسداد نقاط فعال نشده از %1 BSA استفاده گردید. تمامی مراحل کار با استفاده از تکنیک ولتامتری چرخه ای که تغییرات سطح الکترود را نشان میدهد ضبط گردید. برای رصد کردن یون کلسیم از غلظت 1 نانومولار CaCl2 به روش لکه گذاری به مدت 30 دقیقه استفاده شد. کاهش پیک اکسید و احیا مربوط به ولتامتری چرخه ای نشاندهنده حس شدن و شناسایی زیستی یون کلسیم با این روش میباشد.

کلیدواژه ها:

فتوپروتئین های وابسته به کلسیم ، آکوئورین ، بیوسنسور الکتروشیمیایی ، ولتامتری چرخه ای