کلونینگ، بیان و بررسی فعالیت پروتیین استرپتوکینازحاوی موتاسیون در دومینهای آلفا، بتا وگاما

استرپتوکیناز یکی ازمهمترین داروهای مورد استفاده درمان گرفتگی های عروق خونی می باشد اما باوجود برتری نسبت به داروهایترومبولیتیک دیگر ،عوارضی مانندواکنش های آلرژیک ایجاد کرده ونیاز به افزایش نیمه عمر آن در بدن می باشد. یکی از راه های کاهش اینمشکلات، پگیلاسیون اختصاصی (اتصا ل پلیمر صناعی PEG) روی اسیدآمینه سیستیین می باشد. درپروژه های قبلی سه پروتیین موتانت حاوی سیستیین (موتاسیون دراسیدآمینه های 45، 263 و 319) طراحی ومشخص گردید که هرسه فعالیت بیولوژیک مناسبی داشته وبرایپگیلاسیون اختصاصی قابل استفاده اند. هدف ازاین تحقیق ایجاد استرپتوکینازی است که هر سه موتاسیون رادر یک رشته داشته وفعالیتش باپروتیین دست نخورده مقایسه گردد. ابتد اژن حاوی سیستیین 45 به عنوان الگو انتخاب و با SOEingPCR در جایگاه 263، موتاسیون ایجاد شد. پس از تایید ایجاد موتاسیون با تعیین توالی، موتاسیون دوم با همان روش در جایگاه 319 ایجاد شد. ژن حاوی سه موتاسیون (SKC3) در pET26-b کلون و سازه حاصل در سویه RosettaE.coli ترنسفورم شده و SKC3 توسط القاء با IPTG بیان شد. بیان پروتیین با SDS-PAGE و وسترن بلات بررسی و بوسیله افینیتی کروماتوگرافی تخلیص شد. فعالیت سنجی SKC3 در مقایسه با پروتیین دست نخورده (Ski) به روش کروموژنیک انجام شد. پارامترهای کینتیکی حاصل شامل (K(cat), K(m), V(max و بازده فعالیت آنزیمی محاسبه گردید. (K(m دو پروتیین بسیار نزدیک به هم بود اما (V(max و (SKC3 K(cat از Ski بیشتر بوده و نهایتا بازده آنزیمی حدود 15% افزایش نشان داد. بطورکلی نتایج این تحقیق نشان داد SKC3 فعالیت بیولوژیک مناسبی داشته ومی تواند کاندید مناسبی برای پگیلاسیون اختصاصی معرفی گردد.

کلیدواژه ها:

سیستیین ، پگیلاسیون اختصاصی ، فعالیت سنجی