اثر جهشهای نقطهای بر ویژگیهای ساختاری و کاتالیتیک آنزیم پراکسیداز نوترکیب (HRP)

در زمینههای مختلف بیوتکنولوژی از جمله کیتهای تشخیصی، بیوسنسورها و (HRP) آنزیم پراکسیداز ترب سیاه کوهی بیوکاتالیستها کاربرد فراوانی دارد و به همین دلیل همواره موضوع تحقیقات گسترده بوده است. افزایش کارایی کاتالیتیک وپایداری آنزیم دامنهی کاربردهای آن را گسترش میدهد. امروزه این آنزیم برای مصارف تجاری از ریشهی گیاه ترب سیاه کوهی استخراج میشود. استفاده از میزبان هترولوگ برای کاهش قیمت هزینهها و سهولت تولید و تخلیص آنزیمهایی بادر میزبان هترولوگ و بویژه میزبان HRP کاربردهای گسترده ضروری بهنظر میرسد. از مشکلاتی که بر سر راه بیان پروکاریوتی وجود دارد، عدم گلیکوزیلاسیون میباشد که بر پایداری آنزیم در مقابل دما و پراکسید هیدروژن اثر میگذارد. در این پژوهش دو رزیدوی آسپاراژین در جایگاههای 268 و 13 ، که از نقاط گلیکوزیلاسیون در آنزیم وحشی محسوب میشوندبرای جهشزایی انتخاب شدند. این دو رزیدو بهترتیب با 83 % و 65 % دردسترسپذیری سطحی با آسپارتیک اسید جایگزین شدند. هر دو جهشیافته که در میزبان اشریشیاکولی بیان شدند، افزایش پایداری در مقابل دما ( افزایش در نیمهعمر از 20 دقیقه در آنزیم نوترکیب بدون جهش تا 32 و 67 دقیقه در جهشیافتههای جایگاه 13 و 268 ) و پراکسید هیدروژن (تا سه و kcat برابر) را نشان دادند. علیرغم فاصلهی دور هر دو رزیدو از جایگاه فعال، تغییرات قابل توجهی در پارامترهای سینتیکیمشاهده شد. مطالعات فلوریمتری و فروکش فلورسانس توسط اکریلامید، تغییر چندانی در انعطافپذیری ساختار پروتئین Km گواه بر اتصال کمتر این ترکیب به پاکتهای هیدروفوبی در نمونههای جهشیافته بود. ،ANS نشان ندادند ولی بررسی اتصالایجاد جهشیافتهی دوگانه، اثر افزایندهی هر دو جهش را نداشت.

کلیدواژه ها:

پراکسیداز ترب کوهی ، جهش نقطهای ، مقاومت دمایی ، پراکسید هیدروژن ، گلیکوزیلاسیون