طراحی، بهینه سازی و سنتزژنPfu پلیمراز براساس ترجیح کدونی باکتری اشریشیا کولی

امروزه از تکنیک پرکاربردPCRدر بیولوژی مولکولی جهت تکثیر قطعهDNAهدف استفاده می شود. این تکنیک متکی بر چرخه های حرارتی بوده و مهمترین بخش آن آنزیمDNAپلیمراز مقاوم به حرارت می باشد. از آنزیم هایDNAپلیمرازی استفاده شده درPCR می توان به آنزیمPfuپلیمراز جدا شده از باکتری گرمادوستPyrococcus furiosusاشاره کرد که دارای فعالیت پلیمرازی5به3واگزونوکلئازی 3به5 میباشد در این تحقیق هدف افزایش بیان آنزیمPfuدر باکتریE.coliمی باشد. از مهمترین فاکتورهای کاهش دهنده بیان پروتئین نوترکیب در میزبان جدید، وجود کدون های نادر در توالی ژنی می باشد. در طراحی ژن کدکنندهPfuبرای بیان باکتریایی، ترجیح کدونیE.coli BL21 در نظر گرفته شد. علاوه بر بهینه سازی کدونی، بهینه سازی ژنی نیز انجام شد و فاکتورهای منفی موثر در بیان ژن از قبیل موتیف های ناپایدارکننده mRNAتوالی های غنی ازGCجایگاه های اتصال ریبوزوم ناخواسته و ... از ساختار ژنی حذف گردید و ژن جدید باCOIبرابر با0/91طراحیAccession No. KF836420 و سنتز شد. کلونینگ ژن سنتزیPfuپلیمراز در وکتور بیانیpET21aتحت کنترل پروموترT7با استفاده از آنزیم های محدودکنندهHindIII و BamHIانجام شد. بیان آنزیمPfuپلیمراز نوترکیب در حضور0/2میلی مولارIPTGبه صورت داخل سلولی القا گردید. میزان بیان پروتئین نوترکیب بر روی ژلSDS-PAGEبررسی شد و در ادامه صحت تاخوردگی پروتئین و فعالیت پلیمرازی آنزیمPfuنوترکیب با استفاده از واکنش PCRتایید گردید.

کلیدواژه ها:

ترجیح کدونی ، کلونینگ ، Pfuپلیمراز ، ، و pET21a ، Pyrococcus furiosus