طراحی و ساخت وکتور بیانی برای مخمر پیکیا پاستوریس با پروموترFMD

سلول های مخمری با توجه به میزان بیان بالا و سرعت رشد مناسب، میزبان های ایده آلی برای تولید پروتئینهای نوترکیب در صنعت محسوب می شوند. از مخمرهای صنعتی می توان به مخمر متیلوتروف پیکیا پاستوریس اشاره کرد. اغلب برای بیان پروتئین نوترکیب درمخمرP. pastorisاز پروموتر قوی و القاییAOX1استفاده می شود. یکی از مشکلات استفاده از این پروموتر، اضافه کردن دائمی متانول به عنوان القاکننده در محیط کشت بیانی و افزایش خطر اشتعال و همچنین هزینه های تولید می باشد در اینجا از پروموتر قوی و القاییFMDدر ساختار وکتور بیانی مخمر استفاده شد؛ که این پروموتر در غلظت های پائین گلوکز القا شده و بیان ژن تحت کنترل خود را انجام خواهد داد. از وکتور بیانیpPinkα-HCبه عنوان وکتور پایه استفاده شد که دارای پروموترAOX1و سیگنال پپتید ترشحیMFαدر بالادست جایگاه کلونینگ و ترمیناتورCYC1در پائین دست آن می باشد. پس از تعیین نمودن توالی پروموتری FMDو سیگنال پپتید ترشحیMFαو همچنین طراحی سایت های برشی، توالی نهایی در وکتورpUC57سنتز شد. هضم آنزیمی بر روی پلاسمیدpUC57-FMD-MFαبا آنزیم های محدود کنندهKpnI و BamHIانجام شد و قطعه ژنیFMD-MFαبا اندازه 1380 جفت باز روی ژل آگاروز جدا گردید. در ادامه هضم آنزیمی وکتور بیانی مخمریpPinkα-HCجهت حذف پروموترAOX1با آنزیم های محدود کنندهKpnI و BglIIانجام شد و کلونینگ قطعهMFα-FMDدر وکتورpPinkα-AOX-1انجام گردید. صحت ساختاروکتور جدید با تعیین توالی تایید شد.

کلیدواژه ها:

پیکیا پاستوریس ، AOX1 ، پروموترpPinkα-HC ، FMD