طراحی و ساخت یک لوسیفراز پایدار در مقابل حرارت با استفاده از جهش زایی هدفدار

در بیشتر سیستم های بیولومینسانس، آنزیم لوسیفراز اکسیداسیون لوسیفرین و تولید نور را کاتالیز می کند. لوسیفراز حشره شب تاب Photinus pyralisیک زنجیره پلی پپتیدی 62 کیلودالتونی است که از سیستم های بیولومینسانس بسیار کارامد بوده و در نقش گزارشگرابزاری مناسب در نانوسامانه های زیستی می باشد. مطالعات دینامیک مولکولی نشان داده است کهE428نقش مهمی در پایداری حرارتی و فعالیت بیشینه آنزیم لوسیفراز دارد. این مطالعه جهت بررسی نقش این آمینو اسید وچگونگی تاثیر آن بر کارکرد آنزیم انجام گرفته است جهش زایی با روشPCRتغییرسریع انجام شد. سپس محصولاتPCRبه باکتری DH5aکه یک میزبان متداول برای تکثیر پلازمید در آزمایشگاه های زیست شناسی است ترانسفورم گردید. برای حصول پروتئین، پلازمید استخراج شده ، متعاقب آن بهBL21 که یک میزبان بیانی پروتئین است ترانسفورم شد. پروتئین حاصل تخلیص شد و برای مطالعات بیشتر مورد استفاده قرار گرفت بر اساس داده های بدست آمدهKmبرای لوسیفرین وATPبترتیب 15 و 103 میکرومولار بود. همچنین فعالیت ویژه محاسبه شده 108×2/5RLU s-1 mg-1 بود. فعالیت باقیمانده به عنوان شاخصی از پایداری حرارتی در فواصل زمانی 0 تا 45 دقیقه انجام شد و داده ها پایداری حرارتی کمتری را برای نوع جهش یافته نشان داد. بعلاوه سرعت تخریب 1/61s-1 بود و تغییرات ساختاری با استفاده از فلوئورسانس ذاتی و خارجی ودورنگ نمایی حلقوی مطالعه گردید نتایج بدست آمده نشان داد کهE428Rباعث کاهش فعالیت آنزیم می شود اما در پایداری حرارتی آنزیم تاثیر چشمگیری ندارد.این یافته با داده های حاصل از دینامیک مولکولی در تناقض می باشد. همچنین Kmآنزیم در مقایسه با آنزیم طبیعی تفاوت اندکی را نشان داد

کلیدواژه ها:

لوسیفراز ، Photinus pyralis ، پایداری حرارتی ، دینامیک مولکولی ، PCR