بهینه سازی جداسازی اگزوزوم های مشتق از پلاکت با استفاده از سانتریفیوژ متوالی در روش رسوب دهی با پلیمر

چکیده سابقه و هدف  اگزوزوم ها دسته ای از وزیکول های خارج سلولی هستند که از طریق مسیر اندوزومال آزاد می شوند و قطری بین ۱۵۰-۳۰ نانومتر دارند. محتوای آن ها شامل ماکرومولکول های زیستی از جمله DNA ، RNA و پروتئین ها می باشد. اگزوزوم های مشتق از پلاکت، فراوان ترین نانوذرات جریان خون هستند. از آن جا که یافتن روشی ساده و کارآمد برای جداسازی این وزیکول ها بسیار با اهمیت است، در این پژوهش روش موثری بر مبنای رسوب پلیمری جهت جداسازی اگزوزوم های پلاکتی معرفی شده است.  مواد و روش ها در این مطالعه تجربی، نمونه های کنسانتره پلاکتی تهیه شده به روش پلاسمای غنی از پلاکت پس از یک روز ذخیره سازی، از سازمان انتقال خون ایران تهیه شد. در پایان روز ۳، دو دستورالعمل مختلف در دورهای سانتریفیوژ و بر مبنای رسوب پلیمری، جهت جداسازی اگزوزوم های پلاکتی استفاده شد. اندازه ذرات جدا شده توسط تفرق دینامیکی نور یا DLS مقایسه شد (n=۲). هم چنین غلظت ذرات جدا شده با روش بردفورد تعیین شد (n=۲) و آنالیز وسترن بلات برای نشانگر اگزوزومی CD۶۳ انجام شد. یافته ها نتایج حاصل از تحلیل DLS نشان داد که در دستورالعمل A، ذرات جداشده دارای توزیع اندازه گسترده تری بودند و بیش از ۷۳% ذرات در محدوده خارج از اندازه اگزوزوم (بزرگتر از ۱۵۰ نانومتر) قرار داشتند. در مقابل، در دستورالعمل B که شامل مراحل سانتریفیوژ در چند دور متوالی و رو به افزایش بود، ۱۰۰% ذرات در بازه اندازه ۳۰ تا ۱۵۰ نانومتر (محدوده اگزوزوم) قرار گرفتند و توزیع اندازه بسیار یکنواخت تری مشاهده شد. هم چنین، نتایج روش بردفورد نشان دهنده میانگین غلظت پروتئین ذرات استخراج شده، معادل mg/mL ۰.۴۲۴ ± ۰.۱۲ در دستورالعمل A و mg/mL ۰.۱۹ ± ۲.۶۲ در دستورالعمل B بود. تجزیه و تحلیل وسترن بلات نیز بیان پروتئین  نشانگر اگزوزومی CD۶۳ را در ذرات جداشده تایید کرد.  نتیجه گیری             در این مطالعه مشخص شد که انجام چند مرحله سانتریفیوژ متوالی در روش رسوب پلیمری، نقش موثری در جداسازی اگزوزوم های خالص تر با اندازه یکنواخت دارد. این مطالعه روش بهینه شده ای را جهت جداسازی اگزوزوم های خالص تر بر مبنای رسوب پلیمری معرفی می کند.

کلیدواژه ها:

Keywords: Extracellular Vesicles ، Exosomes ، Platelets ، Dynamic Light Scattering ، وزیکول های خارج سلولی ، اگزوزوم ها ، پلاکت ها ، تفرق دینامیکی نور