غیرفعال سازی ۱-HSV با متیلن بلو و نور مرئی: همبستگی کاهش TCID۵۰ با بیان RNA گلیکوپروتئین D با روش RT-qPCR

چکیده سابقه و هدف  علی رغم پیشرفت های قابل توجه در سلامت خون، خطر انتقال عوامل عفونی هم چنان یک چالش برای مراکز انتقال خون است. برای افزایش سلامت خون، روش هایی برای حذف یا غیرفعال کردن ویروس ها توسعه یافته است. این مطالعه بر غیرفعال سازی  ویروس هرپس سیمپلکس نوع ۱ ( HSV-۱)با استفاده از متیلن بلو و نور مرئی در پلاسما تمرکز دارد و اثربخشی غیر فعال سازی را با روش های qRT-PCR و TCID۵۰ مقایسه می کند. مواد و روش ها در یک مطالعه تجربی سلول Vero در محیط DMEM با ۱% پنی سیلین-استرپتومایسین و ۱۰% سرم جنین گوساله در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد با ۵% CO۲ کشت داده شدند. تیتر ویروس با آلوده سازی این سلول ها تعیین شد. متعاقب آن، ذخیره ویروس در حجم ۰/۱ پلاسما به آن اضافه شد. ویروس به پنج واحد پلاسمای جداگانه که از اهداکنندگان خون مختلف به دست آمده بود، اضافه شد. پنج نمونه پلاسمای حاوی ویروس با متیلن بلو ۱ میکرومولار تیمار شدند و سپس به مدت ۱۰ دقیقه در طول موج ۶۲۷ نانومتر تحت پرتودهی قرار گرفتند.  تیتراسیون ویروس در پلیت های ۹۶ چاهکی انجام شد و تیتر ویروس قبل و بعد از پرتودهی از طریق رقت های سریالی ۱۰ برابری با روش  TCID۵۰اندازه گیری شد. گروه کنترل شامل پلاسمای بدون ویروس، پلاسمای حاوی ویروس پرتودهی شده بدون متیلن بلو و پلاسمای حاوی متیلن بلو بدون پرتودهی بود. پس از استخراج RNA ازرقت ها و ساخت cDNA ، بیان گلیکوپروتئین D با qRT-PCR اندازه گیری شد. تمامی آزمایش ها ۳ مرتبه تکرار گردید. در نهایت محاسبات آماری و تجزیه و تحلیل داده ها با نرم افزار ۲۶ SPSS انجام شد و ضریب همبستگی پیرسون بین دو آزمایش محاسبه گردید.  یافته ها قبل از غیر فعال سازی، تیتر ویروس با مشاهده اثرات سیتوپاتیک در سلول های Vero به صورت TCID۵۰/mL  ۱۰۷ تعیین شد. پس از غیرفعال سازی با متیلن بلو و پرتودهی، تیتر به TCID۵۰/mL ۱۰۲ کاهش یافت که نشان دهنده کاهش ۵ لگاریتمی است. میانگین چرخه آستانه (Ct) ژن گلیکوپروتئین D در کشت های سلولی حاوی HSV-۱ غیرفعال نشده (TCID۵۰/mL ۱۰۷(، ۲۲/۶ (۲۲/۶ Ct=) بود، در حالی که میانگین Ct ژن گلیکوپروتئین D در نمونه های پلاسما پس از غیرفعال شدن توسط متیلن بلو و نور مرئی (TCID۵۰/mL ۱۰۲)، ۲۸ (۲۸ Ct=)، بود . این نشان دهنده کاهش ۱۵ برابری در بیان گلیکوپروتئین D است (۰.۰۰۱ =p). نتیجه گیری             بین مقادیر لگاریتمی TCID۵۰ و مقادیر Ct به دست آمده از روش qRT-PCR همبستگی مشاهده شد. روش های مولکولی مبتنی بر بیان گلیکوپروتئین (gD mRNA) D ممکن است به عنوان یک رویکرد مفید برای تشخیص عفونت فعال HSV به کار گرفته شوند.

کلیدواژه ها:

Virus Inactivation ، Herpes Simplex Virus Infection ، methylene blue ، visible light ، RT-PCR ، غیرفعال سازی ویروس ، ویروس هرپس سیمپلکس ، متیلن بلو ، نور مرئی ، RT-PCR