ارزیابی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‎ های عدس با استفاده از نشانگرهای ISSR

چکیده مبسوط: مقدمه و هدف: عدس با نام علمی Lens culinaris Medic یکی از مهمترین گیاهان خانواده بقولات است که نقش مهمی در تامین غذای انسان دارد و به‎ عنوان منبع مهمی از پروتئین شناخته می‎ شود. ژرم پلاسم غنی از این گیاه در ایران و دنیا وجود دارد. با توجه به این‎که هر ساله تعداد زیادی رقم و لاین‎ های اصلاحی توسط به‎ نژادگران داخلی و خارجی تولید و معرفی می گردند، بررسی تنوع ژنتیکی آنها جهت استفاده در برنامه ‎های اصلاحی امری ضروری است. بررسی تنوع ژنتیکی از طریق نشانگرهای مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و DNA امکان‎ پذیر است. استفاده از نشانگرهای مولکولی جهت بررسی تنوع ژنتیکی نسبت به سایر نشانگرها به ‎دلیل عدم تاثیر عوامل محیطی و چندشکلی گسترده اعتبار بیشتری دارد. در این میان، نشانگر ISSR به ‎عنوان یک نشانگر غالب کارایی بالایی در بررسی تنوع ژنتیکی و روابط ژنتیکی بین ژنوتیپ ‎های مختلف گیاهان به‎ خصوص عدس از خود نشان داده است. به‎ همین دلیل، این پژوهش جهت بررسی تنوع ژنتیکی لاین‎ های مختلف و چند رقم متداول عدس به‎ کمک نشانگر ISSR طراحی و اجرا گردید. مواد و روش ها: در این آزمایش، نمونه ‎های برگ تازه ۳۶ ژنوتیپ عدس (شامل ۳۳ لاین جدید و سه رقم متداول)، که از ایستگاه تحقیقات دیم گچساران تهیه شده بودند، برداشت و در دمای ۴۰- درجه سلسیوس منجمد شدند. سپس، DNA به روش CTAB استخراج گردید و کیفیت آن بر روی ژل آگارز و کمیت آن به کمک اسپکتروفوتومتر در آزمایشگاه مرکزی دانشکده کشاورزی دانشگاه یاسوج مورد بررسی قرار گرفتند. نمونه ‎های DNA با کیفیت مناسب جهت ادامه کار انتخاب شدند. سپس، تکثیر به کمک PCR با کمک ۲۰ آغازگر ISSR که در مطالعات قبلی چندشکلی بالایی در سایر گیاهان نشان داده بودند، انجام گردید. در نمونه‎ های مطلوب، وجود و عدم وجود نوار به ‎ترتیب با یک و صفر امتیازبندی شدند. سپس، تجزیه و تحلیل‎ های آماری از قبیل درصد نوارهای چندشکل، محتوای اطلاعات چندشکلی و شاخص شانون محاسبه شد و کارایی آغازگرها مورد بررسی قرار گرفت. سپس گروه‎بندی ژنوتیپ‎ ها به‎ وسیله تجزیه خوشه ‎ای (ضریب تشابه جاکارد و روش UPGMA) و تجزیه به مولفه‎ های اصلی انجام شد و ژنوتیپ‎ های با بیشترین فاصله ژنتیکی جهت ادامه برنامه‎ های اصلاحی معرفی شدند. از نرم‎ افزارهای Excel ,NTSYS PC ۲.۰۲ و Popgene ۱.۳۲در این مطالعه استفاده شد. یافته‎ ها: در مجموع، ۱۹۰ نوار تولید شدکه ۱۸۶تای آن‎ها چندشکل بودند. آغازگر UBC۸۴۰ بیشترین تعداد نوار (۱۷ نوار) را تولید نمود که همگی آن‎ها چندشکلی نشان دادند. در بین آغازگرها، بیشترین میزان محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) متعلق به آغازگر UBC۸۳۰ (۰/۴۹) و کمترین میزان آن متعلق به آغازگر UBC۸۱۴ (۰/۱۳) بود. نه آغازگر دارای PIC بیشتر از ۰/۴ بودند که برای تفکیک ژنتیکی ژنوتیپ‎ ها مناسب تشخیص داده شدند. میانگین شاخص شانون ۰/۸۴۵ بود. بیشترین شاخص شانون که تنوع درون‎ جمعیتی را نشان می دهد مربوط به آغازگر UBC۸۵۳ با (۱/۴) و کمترین آن مربوط به آغازگر UBC۸۱۴ (۰/۳) بود. به‎ طور کلی، با توجه به ویژگی‎ های اندازه‎ گیری شده، آغازگرهای UBC۸۵۵ و UBC۸۵۳ جهت مطالعات ژنتیکی در عدس معرفی شدند. تجزیه خوشه‎ ای ۳۶ ژنوتیپ عدس را به پنج گروه تفکیک نمود. در گروه اول (C۱) دو ژنوتیپ، در گروه دوم (C۲) اکثر ژنوتیپ‎ ها (۵۵/۶ درصد)، در گروه سوم (C۳) دو ژنوتیپ، در گروه چهارم (C۴) ۱۱ ژنوتیپ، و در گروه پنجم (C۵) فقط یک ژنوتیپ قرار گرفتند. بیشترین فاصله ژنتیکی بین ژنوتیپ گروه پنجم و ژنوتیپ ‎های گروه دوم بود (به‎ عنوان مثال، ضریب تشابه جاکارد ۰/۰۸ بین ژنوتیپ ۳۳ و ژنوتیپ ۱۹). بنابر این، انتظار می‎ رود که از تلاقی بین ژنوتیپ ۳۳ (گروه پنجم) با ژنوتیپ ‎های گروه دوم شاهد تفکیک متجاوز بیشتری بود. ارقام سپهر و کیمیا در یک گروه قرار گرفتند که احتمالا بیانگر منشا یکسان آن‎ها است در حالی‎که رقم گچساران در گروه متفاوت قرار گرفت. اکثر ژنوتیپ ‎ها با منشا یکسان در یک گروه قرار گرفتند، هرچند تفاوت‎ هایی نیز مشاهده گردید. تجزیه به مولفه‎ های اصلی نشان داد که مولفه ‎های زیادی در توجیه واریانس کل نقش داشتند؛ به‎ عنوان مثال، پنج مولفه اول ۵۱/۸۲ درصد از واریانس کل را توجیه نمودند. این نتیجه بیانگر توزیع مناسب آغازگرهای مورد استفاده در ژنوم عدس است. گروه‎ بندی ژنوتیپ‎ ها براساس دو مولفه اول تا حدی گروه ‎بندی حاصل از تجزیه خوشه ‎ای را تایید نمود هر چند که تفاوت‎ هایی نیز با آن داشت. در تجزیه خوشه‎ ای، تمام واریانس‎ ها در گروه ‎بندی نقش داشتند در حالی‎که فقط ۴۲/۰۹ درصد از واریانس کل در گروه‎ بندی حاصل از دو مولفه اول نقش داشتند. بنابر این، وجود تفاوت در نتایج گروه ‎بندی‎ ها دور از انتظار نیست.     نتیجه‎ گیری: همانند برخی مطالعات، نشانگرهای ISSR مورد استفاده در این پژوهش کارایی بالایی را جهت بررسی تنوع ژنتیکی و تفکیک ژنوتیپ‎ های عدس نشان دادند. در این میان، دو آغازگر UBC۸۵۵ و UBC۸۵۳ در مقایسه با سایر آغازگرها برتر بودند. با توجه به چندشکلی گسترده که این آغازگرها نشان دادند، پیشنهاد می‎ گردد که از آنها جهت مطالعه تجزیه ارتباطی با صفات مهم عدس از جمله تحمل به خشکی، عملکرد دانه و درصد پروتئین استفاده نمود تا بتوان گام اساسی برای اصلاح این صفات برداشت. از طرف دیگر، تنوع وسیعی میان ژنوتیپ‎ های مورد مطالعه از نظر نشانگرهای ISSR مشاهده شد. گروه‎ بندی ژنوتیپ ‎ها نشان داد که می ‎توان ژنوتیپ‎ های با فاصله ژنتیکی زیاد را جهت ادامه برنامه ‎های اصلاحی عدس انتخاب و معرفی نمود. در این میان، بیشترین فاصله ژنتیکی بین تنها ژنوتیپ گروه پنجم با ژنوتیپ‎ های گروه دوم مشاهده شد که پیشنهاد می‎ گردد از آن‎ها در مطالعات بعدی استفاده گردد.

کلیدواژه ها:

Molecular markers ، Polymorphism ، Polymorphism information content ، Shannon index ، چندشکلی ، شاخص شانون ، محتوای اطلاعات چندشکلی ، نشانگرهای مولکولی