بررسی تغییر بیان ژن های toxAو algD در باکتری Pseudomonas aeruginosa تحت تاثیر عصاره و نانو امولسیون نقره حاوی عصاره گونه انحصاری ایرانی پونه سای بینالودی (Nepeta binaludensis Jamzad.)

سابقه و هدف: گونهNepeta binaludensis  گیاهی کمیاب، معطر و انحصاری است که به دلیل محتوای فنلی و فلاونوئیدی دارای فعالیت ضد باکتریایی است. با توجه به گسترش مقاومت آنتی بیوتیکی، بررسی روش های درمانی نوآورانه مانند استفاده از ترکیب های مشتق شده از گیاهان همراه نانوذرات لازم به نظر می رسد؛ زیرا این روش ها اغلب ضمن افزایش خواص ضد باکتریایی گیاهان دارویی، مقدار مصرف این گیاهان ارزشمند را کاهش داده و در حفظ آنها موثر هستند. در این پژوهش، خواص ضد میکروبی نانوامولسیون نقره حاوی عصاره گیاه پونه سای بینالودی و تاثیر آن بر بیان ژن toxA که در ترشح توکسین A و ژن algD که در تشکیل لایه نازک زیستی در باکتری سودوموناس آئروژینوزا نقش دارند، مطالعه شد.      مواد و روش ها: سرشاخه های گلدار پونه سای بینالودی از ارتفاع ۲۵۱۷ متری کوه بینالود واقع در شمال شرق استان خراسان رضوی جمع آوری شد. عصاره اتانولی این گیاه با روش خیس کردن، از ۴۰ گرم پودر گیاه خشک شده بدست آمد. مقادیر ترکیب های فلاونوئیدی و فنلی عصاره به کمک دستگاه HPLC مورد سنجش قرار گرفت. در این مطالعه، نانوامولسیون نقره حاوی عصاره که پیش از این با روش انرژی بالا ساخته شده بود مورد استفاده قرار گرفت. با استفاده از روش های FTIR، SEM، DLS، ظرفیت زتا و XRD صحت سنتز نانوامولسیون مورد ارزیابی قرار گرفت. خواص آنتی باکتریال غلظت های مختلف نانو ذره نقره، عصاره تام و نانوامولسیون نقره حاوی عصاره بر روی سویه استاندارد باکتری سودوموناس آئروژینوزا با آزمون انتشار دیسک کربی- بائر و با روش رقت سریالی میکرودایلوشن ضمن تعیین MIC و  MBC مورد بررسی قرار گرفت. استخراج RNA ها از باکتری های تحت تیمار با غلظت های MIC و  subMICاز نانوذره نقره، عصاره تام و نانوامولسیون نقره عصاره به طور جداگانه انجام شد. پس از سنتز cDNA تغییرات بیان ژن های toxA و algD با استفاده از Real-Time PCR مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج حاصل از آزمایشReal-Time PCR  به وسیله نرم افزار REST مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج با آزمون تجزیه واریانس یک طرفه با استفاده از نرم افزارهای Microsoft Excel ۲۰۱۶ و GraphPad Prism ۹.۵.۱ در سطح معناداری (P value < ۰.۰۵) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتایج: سنجش مقدار برخی ترکیب های عصاره با HPLC نشان داد که عصاره این گیاه فاقد گالیک اسید، کاتکین، روتین و کوئرستین است. در بین ترکیب های فنلی مانند کلروژنیک اسید، کافئیک اسید، سالیسیلیک اسید و رزمارینیک اسید بیشترین مقدار مربوط به رزمارینیک اسید به میزان ۲۰.۸۲ میلی گرم بر گرم بود. ارزیابی های نانوامولسیون سنتز شده تایید کرد که ذرات این نانوامولسیون کروی و به قطر حدود ۲۷۰ نانومتر بوده و بار سطحی آن منفی و غیر کریستالی است. حضور آب و پیوندهای استری نیز مشخص گردید. یافته های بدست آمده از آزمون انتشار دیسک کربی- بائر نشان داد که کمترین قطر به مقدار ۱۲ میلی متر مربوط به تیمار با نانو ذره نقره بود. بیشترین قطر هاله عدم رشد با مقدار ۲۱ میلی متر مربوط به تیمار با نانوامولسیون عصاره بود که تقریبا مشابه میزان هاله عدم رشد القا شده توسط آنتی بیوتیک سفتازیدیم (CAZ ۳۰µg) بود. کمترین مقدار MBC، MIC و  subMICبه ترتیب به میزان ۸۰، ۴۰ و  µg.ml-۱۲۰ مربوط به تیمارهای نانوامولسیون عصاره بود. میزان بیان ژن algD، فقط تحت تیمار با غلظت MIC نانوامولسیون حاوی عصاره گیاه (µg.ml-۱۴۰)،۰.۸۷ برابر کاهش نسبت به کنترل نشان داد (P < ۰.۰۱). تحت تیمار با نانوامولسیون نقره حاوی عصاره گیاه، بیان ژن  toxAبه میزان ۰.۷۸ برابر کنترل، کاهش معنی دار در سطح ۵ درصد نشان داد. به طوری که تغییر بیان این ژن تحت تاثیر مقادیر MIC عصاره تام گیاه و نانوذره نقره در مقایسه با کنترل تفاوت معنی داری نداشت. نتیجه گیری: نانوامولسیون عصاره گیاه قدرت ممانعت از رشد و باکتری کشی بیشتری دارد. با توجه به اینکه ژن algD در تشکیل بیوفیلم موثر است و ژن toxA مسئول ترشح پروتئین سمی اندوتوکسینA می باشد، این احتمال وجود دارد نانوامولسیون نقره عصاره گیاه از طریق تاثیر بر بیان این ژن ها در باکتری سودوموناس آئروژینوزا بتواند موجب مهار رشد در این باکتری گردد. کاهش اندازه قطرات عصاره درون نانوامولسیون، غلظت ترکیبات فعال زیستی و ظرفیت ضد باکتریایی را در مقایسه با عصاره خالص افزایش داد؛ بنابراین می توان از آن در صنایع داروسازی و غذایی استفاده کرد.

کلیدواژه ها:

سودوموناس آئروژینوزا ، ضد میکروبی ، نانو امولسیون نقره ، Nepeta binaludensis ، toxA ، algD