تجزیه فیلوژنی برخی ژن‎ های مسیر بیوسنتزی اسیدکلروژنیک در گیاه دارویی شیرتیغک وحشی (.Sonchus arvensis L)

چکیده مبسوط مقدمه و هدف: شیرتیغک وحشی (L.Sonchus arvensis ) گیاهی دارویی از خانواده کاسنیان است. خواص دارویی ارزشمند این گیاه به‎دلیل وجود اسیدهای فنلی مهم و با ارزشی مانند اسید‎کلروژنیک است. کاهش خطر ابتلا به بیماری‎های مختلف مانند بیماری‎های قلبی، دیابت و سرطان به‎دنبال مصرف اسید‎کلروژنیک در مطالعات بالینی و تحقیقی به اثبات رسیده است. بنابراین، تحقیقات بیشتری در زمینه پزشکی و داروسازی در این گیاه در آینده مد نظر محققین است. هم‎چنین، اطلاعات کمی درباره ژنتیک متابولیسم ثانویه در گیاهان دارویی وجود دارد، به‎طوری که ژن‎های بسیاری از مسیرهای بیوسنتز متابولیت‎های ثانویه شناسایی نشده ­اند و اطلاعات کمی درباره تنظیم و عملکرد انواع آن‎ها وجود دارد. بنابراین، شناسایی مسیرهای بیوسنتزی و اطلاع از نحوه تنظیم ژن‎های دخیل در این مسیرها و تجزیه فیلوژنی آن‎ها اهمیت ویژه‎ای دارد. از سویی، بررسی روابط فیلوژنتیکی ژن‎ها در گونه‎های مختلف گیاهی و تعیین روابط تکاملی بین آن‎ها می‎تواند در درک بهتر سیر تحول گونه‎ها کمک کند. هم‎چنین، اطلاع از توالی نوکلئوتیدی ژن‎ها و فراوانی نوکلئوتیدهای مختلف جهت برآورد زمان واگرایی گونه‎ها و احیا کردن روابط تکاملی میان گونه‎های مختلف ضروری است. هدف از تحقیق حاضر توالی‎یابی بخشی از ناحیه کد‎کننده ­ی برخی ژن‎های دخیل در مسیر بیوسنتزی اسیدکلروژنیک، مانند سینامات۴-هیدروکسیلاز (C۴H)، P-کوماریول-استر۳'-هیدروکسیلاز (C۳'H) و هیدروکسی سیناموئیل کوآ شیکمات/ کوینات هیدروکسی سیناموئیل ترانسفراز (HCT)، و بررسی روابط تکاملی و فیلوژنی آن‎ها در گیاه شیرتیغک وحشی است. مواد و روش‎ها: از آن‎جایی که توالی ژن‎های C۴H، HCT و C۳'H در گیاه S. arvensis شناسایی نشده بود، توالی‎های آن‎ها از طریق گیاهانی که به لحاظ تکاملی به S. arvensis نزدیک بودند، مانند سایر جنس‎های خانواده کاسنی (کنگر فرنگی: var. scolymus Cynara cardunculus) و کاسنی (Cichorium. intybus) بازیابی شد. ابتدا توالی این ژن‎ها در گیاهانی که از نظر فیلوژنتیکی به S. arvensis نزدیک بودند از GenBank جمع آوری شد. همردیفی با استفاده از نرم افزار Clustal omega انجام گرفت و مناطق حفاظت ‎شده شناسایی شدند. سپس آغازگر‎های اختصاصی براساس نواحی حفاظت‎شده با استفاده از نرم‎افزار‎های Fast PCR ۴.۰ و Gen Runner ۳.۰۵ طراحی شدند. در مرحله بعد، DNA از نمونه‎های برگی به‎روش CTAB استخراج شد و با استفاده از آغازگر‎های اختصاصی طراحی‎شده و واکنش زنجیره‎ای پلیمراز (PCR) قطعات ژن‎های مورد مطالعه در شیر تیغک وحشی تکثیر شدند. الکتروفورز محصولات حاصل با استفاده از ژل آگارز یک و نیم درصد با ولتاژ ۸۰ به‎مدت یک الی دو ساعت انجام شد و پس از رنگ‎آمیزی با اتیدیوم بروماید، عکس‎برداری با استفاده از دستگاه ژل‎داک (INFINITY، فرانسه) صورت‎ گرفت. با توجه به اختصاصی بودن محصولات حاصل از تکثیر، محصولات PCR مستقیما برای توالی‎یابی بخشی از نواحی کد‎کننده‎ی‎ ژن‎های C۴H، C۳'H و HCT به شرکت میکروسینس سوییس ارسال شدند. برای اطمینان، تمام محصولاتPCR  در هر دو جهت رو به جلو و معکوس توالی‎یابی شدند و برای تایید صحت قطعات توالی یابی­ شده، هم‎ردیفی (BLAST) قطعات توالی یابی­ شده در برابر پایگاه های داده DNA،RNA  و پروتئین انجام شد. سپس روابط فیلوژنی و هم‎چنین فراوانی جهش‎های نوکلئوتیدی در این ژن‎ها مورد بررسی و تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. برای بررسی روابط فیلوژنی (روش حداکثر درست‎نمایی) و تجزیه و تحلیل توالی‎های نوکلئوتیدی (شامل فراوانی و جایگزینی) از نرم‎افزارMEGA۵  و BLAST استفاده شد. برای بررسی همردیفی توالی‎های نوکلئوتیدی و پروتئینی از نرم‎افزار Clustal Omega استفاده شد. تجزیه و تحلیل آمینواسید‎ها (درصد و وزن امینواسید‎ها و پروتئین‎های استنباطی) با نرم‎افزار‎های Bio Edit و MEGA۵ و تست Neutrality با نرم‎افزار MEGA۵ انجام‎ گرفت. یافته‎ها: برای اولین‎بار در این تحقیق، بخشی از توالی ناحیه کد‎کننده­ی ژن‎های C۴H، C۳'H و HCT در شیرتیغک وحشی شناسایی و در بانک ژن (GenBank) به ترتیب با شماره ­های دسترسی ON۰۱۴۵۹۷.۱، ON۰۱۴۵۹۵.۱ و ON۰۱۴۵۹۶.۱ ثبت شدند. نتایج مربوط به تجزیه و تحلیل توالی‎های نوکلئوتیدی نشان دادند که بیشترین فراوانی نوکلئوتیدی برای ژن‎های  C۴H، C۳'H و HCT به‎ترتیب مربوط به آدنین (۲۸/۱)، گوانین (۲۸/۴) و تیمین (۲۸/۱) و کمترین فراوانی نوکلئوتیدی به‎ترتیب متعلق به باز‎های تیمین (۱۳/۲)، تیمین (۲۰/۱) و سیتوزین (۱۹/۷) بودند. نتایج تست Neutrality انتخاب جهت‎دار بر روی این ژن‎ها را در طول تکامل نشان دادند. جهش جایگزینی انتقالی بیشتر از جهش جایگزینی تقاطعی بود و آنالیز فیلوژنتیکی براساس توالی‎های ژنیC۴H، HCT وC۳'H  رابطه فیلوژنتیکی نزدیکی بین S. arvensis و کاهو (Lactuca. sativa) را نشان داد. نتایج حاصل از بلاست توالی‎ها در سطح نوکلئوتیدی و پروتئینی، شباهت بالای توالی ژن‎های مورد مطالعه در شیرتیغک وحشی به توالی‎های ژن‎های متناظر در گیاه L. sattiva را نشان دادند. نتیجه‎گیری کلی: نتایج این پژوهش، روند انتخاب طبیعی در طی تکامل برای ژن‎های C۴H، C۳'H و HCT در گیاه شیرتیغک وحشی را مثبت ارزیابی کردند که نشان­ دهنده اثرات رانش ژنتیکی و یا اثرات متعادل ­کننده تکامل جمعیت در طول تاریخ است. نتایج BLAST قطعات ژنی توالی یابی شده‎ی مربوط به ژن‎های C۴H،HCT و C۳'Hدر S. arvensis در سطح نوکلئوتیدی و پروتئینی بیشترین درصد شباهت (کمترین فاصله ژنتیکی) را با گیاهانی مانند L. sativa و C. intybusنشان دادند که تاییدی بر صحت نتایج توالی‎یابی است. هم‎چنین، آنالیز فیلوژنتیکی براساس توالی‎یابی ژن‎های C۴H، C۳'H و HCT رابطه فیلوژنتیکی نزدیکی را بین S. arvensis و L. sativa نشان داد.

کلیدواژه ها:

Blast ، Nucleotide mutations ، Phenolic acid ، Phylogeny analysis ، Sequencing ، S. arvensis ، تجزیه فیلوژنی ، جهش‎ های نوکلئوتیدی ، ژن سینامات۴-هیدروکسیلاز اسید ، شیرتیغک وحشی ، کلروژنیک اسید