بهینه سازی روش ذوب با وضوح بالا: مطالعه موردی روی ژن مسئول تبدیل اولئیک اسید به لینولئیک اسید در گلرنگ

هدف: روش ذوب با وضوح بالا (HRM) یک ابزار مقرون به صرفه، اختصاصی و سریع است که برای تجزیه و تحلیل انواع توالی، غربالگری و ژنوتیپ سنجی کاربرد دارد. این روش بر اساس خواص ذوب DNA دو رشته ای، تغییرات نوکلئوتیدی کوچک را تشخیص می دهد. هدف پژوهش حاضر، بهینه سازی آزمون HRM برای ژنوتیپ سنجی گلرنگ از نظر محتوای اولئیک اسید است. نقش ژن FAD۲-۱، اضافه کردن یک پیوند دوگانه در سوبسترای اولئیک اسید و تبدیل آن به لینولئیک اسید است. در رقم های با محتوای بالای اولئیک اسید، وجود یک SNP در این ژن گزارش شده که موجب به وجود آمدن کدون خاتمه زودرس و از کار افتادن آنزیم حاصل می شود. بنابراین تشخیص صحیح و سریع ژنوتیپ های دارای SNP مذکور در ژن FAD۲-۱ می تواند راه کار مناسبی برای تشخیص ژنوتیپ های گلرنگ با محتوای بالای اولئیک اسید باشد. مواد و روش ها: در این مطالعه، روش HRM با استفاده از دو رنگ فلورسنت اواگرین و سایبرگرین، سه غلظت مختلف DNA ژنومی الگو و دو جفت آغازگر مختلف به نام HRM۱ و HRM۲ (که قطعه حاصل از تکثیر با استفاده از آن ها دربردارنده SNP مذکور بوده و به ترتیب شامل ۱۱۷ و ۲۶۵ جفت باز می باشد) روی هشت ژنوتیپ گلرنگ انجام شد تا شرایط مناسب برای تفکیک منحنی ذوب برای ژنوتیپ های دارای SNP و بدون آن مشخص شود. نتایج: در مقایسه آغازگرهای HRM۱ و HRM۲، آغازگر HRM۱ به دلیل تولید قطعه کوچک ۱۱۷ جفت بازی، تفکیک را بهتر از آغازگر HRM۲ که قطعه بزرگتر ۲۶۵ جفت بازی تولید می کرد، انجام داد و در مقایسه رنگ اواگرین و سایبرگرین، اواگرین توانست در یک واکنش PCR، ژنوتیپ های بیشتری را به درستی تفکیک کند. همچنین، غلظت DNA در محدوده مورد بررسی تاثیر چندانی در تفکیک منحنی های ذوب نداشت. نتیجه گیری: این مقاله یافته های پیشین را تایید و گسترش می دهد که تفکیک منحنی های ذوب برای قطعات تکثیر شده کوچک تر بهتر صورت می گیرد و رنگ اواگرین جایگزین مناسبی برای رنگ سایبرگرین بوده و با استفاده از رنگ اواگرین می توان به کارآیی بهتری دست یافت.

کلیدواژه ها:

اواگرین ، چندشکلی تک نوکلئوتیدی ، منحنی ذوب ، ریل تایم پی سی آر ، ژنوتیپ سنجی