مراحل عملیاتی تکنیک PCR در تشخیص میکروارگانیسمهای زیست محیطی

؛Reaction Chain Polymerase یا به اختصار PCR، به معنای واکنش زنجیره ای پلیمراز برای ساختن تعداد زایدی پی از یک قطعه مورد نظر از DNA در شرایط آزمایشگاهی است، که با دارا بودن قدرت انتخاب پذیری، حساسیت زیاد و سرعت عمل، بعنوان یکی از تکنیکهای مطلوب در تشخیص میکروارگانیسمهای محیط زیست محسوب می شود. مراحل اساسی در هر هسیکل از دستگاههای PCR عبارتند از: 1-جداسازی رشته های DNA هدف در دمای 95 درجه سانتیگراد و در زمان کمتر از 1 دقیقه (Denaturation) 2-اتصال پرایمرها به زنجیره های جداشده DNA هدف در 55 درجه سانتیگراد و در کمتر از 1 دقیقه (Annealing) 3-گسترش پرایمرها توسط DNA پلیمراز در 72 درجه سانتیگراد در زمان 1 دقیقه (extention). DNA الگو، توسط محققین با روش استاندارد استخراج می شود و بقیه مواد مورد نیاز نظیر پرایمرها، نوکلئوتیدهای آزاد، DNA پلیمراز و بافرها معمولاً از مراکز معتبر تهیه می گردند. نمونه مورد نظر به همراه مواد ذکر شرده، در شرایط عاری از آلودگی بیولوژیکی، به ویال مخصوص 250 میکلورلیتری منتقل شده و دستگاه PCR براساس برنامه تعریف شده، حدود 30 سیکل، مراحل فوق را تکرار می کند. بدین ترتیب 230 کپی از قطعه مشخصی از DNA هدف: تهیه خواهد شد. و این مقدار برای تشخیص نهایی کفایت می کند. زمان لازمب اری 30 سیکل، کمتر از دو ساعت می باشد. پرایمرها، مولکولهای تک رشته ای متشکل از 20 الی 30 نوکلئوتید هستند که براساس ساختمان DNA هدف، بعنوان مکمل قطعه اختصاصی زنجیره های DNA میکروارگانیسم مورد نظر، انتخاب و به نمونه اضافه می شوند. بنابراین، جایگاه واکنش پرایمرها در روی زنجیره های جداشده DNA و طول قطعه DNA هدف برای تکثیر، از قبل معلوم بوده ه این موضوع در تفسیر نتایج PCR مورد استفاده قرار می گیرد. DNA پلیمراز که غالباً از ن وعی مایکوباکتریوم گرمادوست بنام (Taq aquaticus mus Ther) استخراج می شود، نوکلئوتیدهای آزاد اضافه شده به نمونه را مرحله به مرحله به انتهای پرایمر اضافه نموده بدینوسیله، مکمل زنجیره DNA هدف ساخته می شود. بمنظور بررسی دقت و صحت عملیات انجام یافته توسط PCR، از شیوه های کنترل مثبت و کنترل منفی استفاده می شود که اجرای آنها به همراه آزمایش اصلی صورت می گیرد. روشهای مختلفی برای تشخیص قطعه ژنوم تکثیر شده وجود دارد که ساده ترین آنها الکتروفورز مقداری از محصول PCR بر روی ژل آگارز و مرئی نمودن آن با نوعی رنگ فلورسنت بنام اتیدیوم بروماید می باشد. لازمب ذکر است که PCR معمولی قادر به تعیین تعداد میکربها نبوده و برای رسیدن به این ه دف بایستی از PCR Time Real استفاده شود.

کلیدواژه ها:

تشخیص میکروارگانیسمها ، PCR