ساخت وکتور بیانی مخمری جدید با ژن گزارشگر GFP در قالب یک اپرون

یکی از مهمترین سیستم های بیانی جهت تولید پروتئین های نوترکیب استفاده از میزبان های مخمری می باشد. بدین منظور وکتورهای مختلفی در این زمینه طراحی و ساخته شده اند که یکی از جدیدترین آنها وکتور pPinkα-HC جهت بیان ترشحی پروتئین نوترکیب در میزبان پیکیا پاستریس است. از امتیازات این وکتور می توان به ترانسفورماسیون پایدار، عدم وجود ژنهای مقاومت آنتی بیوتیکی به عنوان نشانگر، حضور پروموتر قوی و قابل القا AOX1 و بیان ترشحی پروتئین نوترکیب با استفاده از سیگنال پپتید مخمری اشاره کرد، ولی در کنار این محاسن، یکی از اشکالات این وکتور عدم وجود یک ژن گزارشگر در ساختار آن می باشد و در نتیجه در صورت بیان نشدن پروتئین مورد نظر، نمی توان مشکل را ردیابی نمود. در این پژوهش از ژن GFP به همراه توالی IRES به عنوان یک توالی داخلی اتصال ریبوزوم به عنوان ژن گزارشگر پس از ناحیه کلونینگ در پلاسمید pPinkα-HC استفاده شده است. به علت محدودیت جایگاه های برش آنزیمی، ابتدا ناحیه پروموتری AOX1 از وکتور pPinkα-HC با هضم آنزیمی جدا شده و در پلاسمید pIRES2-EGFP کلون گردید. سپس ناحیه ژنی AOX1-IRES-EGFP با استفاده از PCR جدا شده و دوباره در وکتور pPinkα-HC کلون گردید. انجام واکنش PCR و در نهایت تعیین توالی وکتور جدید pPinkα-GFP تأئید کننده صحت ساختار پلاسمیدی ساخته شده است. از این پلاسمید می توان برای ردیابی بیان پروتئین در مخمر پیکیا پاستوریس استفاده نمود.

کلیدواژه ها:

وکتور بیانی ، پیکیا پاستوریس ، ژن گزارشگر GFP