افزایش پایداری حرارتی پروتئین نوترکیب اینورتاز ساکارومایسس سرویزیه با ایجاد جهش های هدفمند

اهداف: اینورتاز آنزیمی است که به صورت گسترده در صنایع مورد استفاده قرار می گیرد. منبع اصلی تولید صنعتی آنزیم اینورتاز مخمر ساکارومایسس سرویزیه است. افزایش پایداری حرارتی در این آنزیم کمک مهمی به افزایش بهره وری در تولید مربوطه خواهد کرد. هدف پژوهش حاضر افزایش پایداری حرارتی پروتئین نوترکیب اینورتاز ساکارومایسس سرویزیه با ایجاد جهش های هدفمند بود. مواد و روش ها: در پژوهش تجربی حاضر، با الگوقراردادن آنزیم اینورتاز باکتری گرمادوست ترماتوگا ماریتیما به منظور افزایش پایداری حرارتی، اسیدآمینه های ترئونین ۳۴۵ و آسپارژین ۳۴۹ در ژن پروتئین اینورتاز ساکارومایسس سرویزیه با روش جهش زایی هدفمند با آلانین جایگزین و در مخمر پیکیا پاستوریس همسانه سازی با واکنش زنجیره ای پلیمراز SOEing انجام شد. فعالیت آنزیم های نوترکیب اینورتاز طبیعی و جهش یافته در دماهای مختلف، pHهای مختلف، مدت زمان پایداری و پایداری حرارتی- عملکردی اندازه گیری و نمودار میکائیلیس- منتن رسم شد. یافته ها: پایداری حرارتی- ساختاری آنزیم های طبیعی و جهش یافته اینورتاز در دمای ۵۵ºC نشان داد که آنزیم جهش یافته در دمای ۵۵ºC نسبت به آنزیم طبیعی پایدرای حرارتی بالاتری داشت. هر دو آنزیم طبیعی و جهش یافته در پایداری عملکردی روند مشابهی را نشان دادند. کاهش Km و افزایش Vmax در سوبسترای ساکاروز و افزایش ۵برابری نسبت Kcat/Km در آنزیم جهش یافته دیده شد. نتیجه گیری: جهش های هدفمند اعمال شده هیچ اثر منفی روی میزان تولید و همچنین ترشح پروتئین نوترکیب اینورتاز ندارد و باعث افزایش فعالیت آنزیم می شود. آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی، پایداری ساختاری بالاتری دارد، بدون این که تغییری در پایداری عملکردی آن ایجاد کند.

کلیدواژه ها:

Invertase ، Pichia pastoris ، Thermal stability ، Site-Directed Mutagenesis ، اینورتاز ، پیکیا پاستوریس ، پایداری حرارتی ، جهش زایی هدفمند