کلونینگ، بیان و تخلیص اندونوکلئاز CEL I نوترکیب در رده سلولی HEK۲۹۳T

اندونوکلئاز CEL I، آنزیمی از خانواده S۱ اندونوکلئازها است. این آنزیم، با اختصاصیت بالا، توانایی شناسایی انواع جهش ها و جایگزینی بازها در مولکول DNA را دارد که این امر اهمیت آن را در قالب محصولات تجاری به منظور مصارف تحقیقاتی و آزمایشگاه های بالینی دوچندان می کند. اگرچه این آنزیم در گیاه کرفس یافت می شود اما به دلیل زمان بربودن فرآیند استخراج و همچنین بازدهی کم محصول نهایی، استخراج آن مقرون به صرفه نیست. علاوه بر این، با توجه به لزوم اعمال تغییرات پس از ترجمه برای دست یابی به ساختار فعال نهایی، تاکنون گزارشی مبنی بر بیان فرم فعال این آنزیم در میزبان های باکتریایی مشاهده نشده است. بنابراین یکی از منابع تولید فرم فعال این آنزیم، کلون و بیان آن در میزبان های یوکاریوتی از جمله مخمر و رده های سلولی پستانداران است. در این مطالعه، توالی ژن به منظور بیان در میزبان یوکاریوتی HEK۲۹۳T بهینه ‎سازی و سنتز شد. سپس توسط هضم دوگانه با آنزیم های KpnI و XhoI در وکتور بیانی pBudCE۴.۱ ساب کلون شد. سازه بیانی مورد نظر توسط لیپوفکتامین به رده سلولی HEK۲۹۳T ترانسفکت و بیان پروتئین نوترکیب از طریق روش های متعددی از جمله SDS-PAGE، الایزا، واکنش نسخه برداری معکوس و وسترن بلات تایید شد. آنالیز داده های SDS-PAGE و وسترن بلات وزن مولکولی در حدود ۳۰کیلو دالتون را تایید کرد. تخلیص با ستون حاوی رزین Ni-NTA انجام و مقدار پروتئین در حدود ۰/۲میلی گرم بر میلی لیتر تعیین غلظت شد. درنهایت فعالیت اندونوکلئازی آنزیم، روی DNA هترودوپلکس حاصل از محصول PCR ژن جهش یافته و وحشی بررسی شد. نتایج نشان داد که بیان این پروتئین در میزبان HEK۲۹۳T فعالیت مناسبی دارد.

کلیدواژه ها:

CEL I Endonuclease ، HEK۲۹۳T Cell Line ، Heteroduplex DNA ، اندونوکلئاز CEL I ، رده سلولی HEK۲۹۳T ، DNA هترودوپلکس