شناسایی بررسی بیان برخی از microRNAهای حفاظت شده دخیل در مسیر بیوسنتز ویتانولیدها در پنیرباد (Withania somnifera)

سابقه و هدف: پنیرباد (Withania somnifera) متعلق به خانواده سیب زمینی، به صورت یک درختچه کوچک همیشه سبز با ریشه­های غده­ای بزرگ است و در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری وجود دارد. ترکیبات اصلی پنیرباد، ویتانولیدها هستند که شامل ویتافرینA، ویتانولیدD، ویتانولیدA و ویتانون­ها می باشند. ویتافرین A و ویتانون­ها بیشتر در برگ­های پنیرباد وجود دارند، در حالی که ویتانولید  Aعمدتا در ریشه تولید می­شود. بیوسنتز این متابولیت ها به ژن­های فارنسیل پیروفسفات (FPP)، سیکلوآرتنول­سنتاز (CAS)، استرول­متیل ترانسفراز (SMT۱) و هیدروکسی متیل گلوتاریل کوآنزیم A ردوکتاز (HMGR)، مرتبط با مسیرهای متابولیک مربوط بستگی دارد و RNAهای غیرکدکننده مانند miRNA­ها در تنظیم  بیان این ژن­ها و آنزیم­ها نقش دارند. ژن­های miRNA­ها، RNAهای کوچک با طول ۱۸- ۲۴ نوکلئوتید هستند که هیچ پروتئینی کد نمی­کنند و بروز ژن را در گیاهان و حیوانات تنظیم می­کنند. این گروه از RNAهای غیر­رمز کننده نقش مهمی در تنظیم بیان ژن پس از رونویسی ایفا می­کنند و به عنوان تنظیم کننده­های منفی بیان ژن در یوکاریوت­ها فعالیت دارند. این تحقیق با هدف شناسایی و بررسی بیان برخی miRNA های حفاظت شده دخیل در بیوسنتز ویتانولیدها در گیاه پنیرباد اجرا گردید.مواد و روش ها: در این پژوهش، برای انجام آنالیز HPLC از دستگاه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا متصل به آشکارساز ELSD، مدل C-۶۵۰ استفاده شد. به منظور شناسایی miRNA های حفاظت شده در گیاه پنیرباد از داده­های  RNA-seqمبتنی بر همولوژی توسط نرم افزار C-mii از BLASTn با معیارهای تا چهار عدم تطابق وE- value < ۱۰  استفاده شد. ساختار ثانویه miRNAهای متمایز به وسیله نرم افزار Mfold تعیین شد. ژن های هدف miRNAهای نامزد با استفاده از psRNATarget بر اساس پارامترهای زیر شامل: E-value < ۱.۰E-۵، تعداد جایگاه­­های مورد هدف برابر۲، محدوده نداشتن بازهای مرکزی بین ۱۰-۱۱ نوکلئوتید، بیشترین عدم تشابه برابر ۲ و بدون هیچ گونه فاصله انتخاب گردیدند و برای پی بردن به عملکرد ژن­های هدف از ابزارBLASTx  علیه پایگاه داده پروتئینی استفاده شد. در مرحله گلدهی نمونه برداری از دو بافت برگ و ریشه سه ژنوتیپ W۱ (۷۶۲۹۲۴۵)،W۳  (۷۶۲۹۲۴۱) و W۴ (۷۶۲۹۲۴۴) با سه تکرار تکنیکی و سه تکرار بیولوژیکی انجام گردید. از Real-time PCR برای ارزیابی بیان miRNA۵۰۲۱ و ژن هدف آن SMT۱ و miRNA۵۱۴۰ استفاده شد و تجزیه داده­های حاصل از بیان با استفاده از روش  CTΔΔ -۲ انجام شد.  یافته ها: با توجه به تجزیه های آماری داده­های حاصل از HPLC، بین مقدار ویتافرین­آ در سه ژنوتیپ (W۱، W۳ و W ۴) از لحاظ آماری اختلاف معنی داری مشاهده نشد. در بین بافت­های مورد مطالعه بیشترین میزان مربوط به برگ W۳ و کمترین به ریشه W۱ اختصاص داده شده است. برای شناسایی miRNAها ساختار دوم توالی­ها با سرور mfold پیش­بینی شد. حداقل انرژی آزاد پیچش (MFE) از ۱۵- تا ۴/۱۳۰- kcal.mol متفاوت بود و میانگین آن ۹۸/۴۲- kcal.mol محاسبه گردید. نتایج حاصل از روش RT-qPCR نشان داد که میزان بیان نسبی miR۵۰۲۱ در ریشه W۱، W۳ و W۴ نسبت به شاهد (بافت برگ W۱)، ۱۶/۱، ۳۷/۱ و ۱۷/۱ به ترتیب افزایش بیان و در برگ W۳ و W۴ به ترتیب ۱/۳ و ۷/۳ برابر کاهش بیان مشاهده شد. الگوی بیان برای ژن SMT۱ در سه ژنوتیپ W. somnifera برای ریشه W۱،  W۳و W۴ به ترتیب ۷/۷، ۸/۲ و ۴ برابر کاهش و در برگ W۳ و W۴ به ترتیب ۴۸/۲ و ۸۲/۱ برابر افزایش بیان نسبت به  شاهد مشاهده شد. همچنین بیان نسبی miR۵۱۴۰ در برگ W۳، ۵۷/۱ و برای W۴ بدون تغییر و در ریشه,WI  W۳ و  W۴نسبت به شاهد به ترتیب هفت، نه و سه برابر کاهش بیان دیده شد که طبق انالیزهای آماری برای miRNA۵۰۲۱ و miRNA۵۱۴۰ در بین  سه ژنوتیپ­ برای هر یک از این ژن­ها اختلاف معنی داری وجود ندارد.نتیجه­ گیری: در مجموع با توجه به نقش تنظیمی miRNAهای شناسایی شده در این مطالعه، می­توان از این ژن­ها در شناسایی بهتر و دقیق­تر مسیر بیوسنتز ویتانولیدها استفاده کرد.

کلیدواژه ها:

miRNA ، Transcriptome ، Target gene ، withaferin A