کاهش بارآلودگی به اندوتوکسین (LPS) قبل از تخلیص محصولات نوترکیب بیان شده در باکتری های گرم منفی با استفاده از طراحی آزمون

در این تحقیق تلاش گردید که بعد از مرحله القاء و بیان پروتئین هدف و قبل از مرحله شکست سلولی، از روش استخراج با فنل داغ با EDTAدر جهت حذف اندوتوکسین یا همان LPS (لیپوپلی ساکارید) از دیواره باکتری اشرشیاکلی حاوی ژن بیان کننده پروتئین ضد میکروبی تترامرS۳ استفاده شد. سلول جدا شده از محیط کشت در شرایط استریل در محلول (Tris-HCl) انکوبه گردید و سپس با افزودن EDTA یون های(+Ca(۲+)/Mg(۲ که مسئول اتصال LPS (لیپوپلی ساکارید) به غشاء سلولی هستند، شلاته شدند. این فرآوری باعث سست شدن اتصال LPS بهدیواره سلولی و در نتیجه آزاد شدن LPS گردید. با سانتریفیوژ کردن نمونه، LPS به صورت محلول جدا شده و بعد از شکست سلولی، احتمالچسبندگی LPS به پروتئین و در نتیجه بارآلودگی محصول کاهش یافت.برای این منظور شرایط فرآوری سلول نوترکیب با EDTA ، شامل غلظت Tris-Hcl مدت زمان فرآوری با Tris-Hcl ، غلظت EDTA ، مدتزمان تماس با EDTA ، به کمک متدلوژی طراحی آزمونها محاسبه و بهینه سازی گردید. در نهایت، سلول نوترکیب بعد از فرآوری بهینه باEDTA ، با استفاده از بافر لیز سلولی و سونیکاسیون شکسته گردید و آلودگی اندوتوکسینی آن به طور قابل ملاحظه ایی کمتر از محصولحالت شکست معمولی بود.

کلیدواژه ها:

لیپوپلی ساکارید ، حذف اندوتوکسین ، استخراج با فنل داغ ، تترامر S۳