بررسی مقایسه ای شرایط طبیعی و واسرشته در محلول سازی و تخلیص پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس

زمینه مطالعه: لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس عامل اصلی تعدیل سیستم ایمنی و تحریک لنفوسیت های T تنظیمی در میزبان می باشد و باعث افزایش جمعیت سلول های(Forkhead box P۳) Foxp۳+ و کاهش التهاب می شود و می تواند به عنوان کاندیدای دارویی در درمان بیماری های خودایمن معرفی شود.هدف: مقایسه تخلیص پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس در دو شرایط واسرشته و طبیعی به منظور افزایش بازیابی و حفظ فعالیت زیستی آن می باشد. روش‎کار: یک توالی به طول ۶۶۰ جفت باز از لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس در پلاسمید pET۳۲-a سنتز و در باکتری اشریشیا کلی BL۲۱(DE۳) در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۶ ساعت با ایزوپروپیل بتا-دی-۱-تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG) ۱ میلی مولار القا و بیان شد. در مطالعه حاضر بافر لیز کننده اوره ۸ مولار (pH=۸) و بافر حاوی ایمیدازول ۰۱/۰ مولار همراه با لیزوزیم ۱ میلی گرم/میلی لیتر برای شکستن سلول های باکتریایی و محلول سازی پروتئین مورد استفاده قرار گرفت. بافرهای فوق همراه با سونیکه کردن، به منظور شکستن سلول های باکتری استفاده شد و لام های میکروسکوپی تهیه و با رنگ آمیزی گرم بررسی شدند. پروتئین نوترکیب استخراج شده تحت شرایط واسرشته و طبیعی با استفاده از رزین نیکل-نیتریلوتری استیک اسید آگاروز و رزین نیکل-نیتریلوتری استیک اسید سفاروز تخلیص شد. ارزیابی ایمونوژنیسیته پروتئین نوترکیب با روش دات بلات با سرم خرگوش چالش شده با پروتئین نوترکیب انجام شد.نتایج: بیشترین مقدار بیان پروتئین با وزن مولکولی ۴۱ کیلودالتون در ساعت ششم پس از القا در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد با IPTG ۱ میلی مولار حاصل شد. بافر اوره ۸ مولار (pH=۸) حاوی لیزوزیم ۱ میلی گرم/میلی لیتر همراه با سونیکه کردن، مقدار زیادی از پروتئین نوترکیب استخراج شد. تخلیص پروتئین تحت شرایط واسرشته با استفاده از رزین نیکل- آگاروز مقدار پروتئین بیشتری نسبت به رزین نیکل سفاروز بازیابی شد. نتایج آزمایش دات بلات نیز حضور آنتی بادی IgG (Immunoglobulin G) اختصاصی علیه پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس در سرم خرگوش ایمن شده تا رقت ۱:۵۰۰ را مورد تایید قرار داد.نتیجه­گیری نهایی: استفاده از روش واسرشته بر فعالیت زیستی پروتئین تاثیر منفی نداشت و با این روش مقدار بیشتری پروتئین در سیستم باکتریایی بازیابی گردید. پروتئین نوترکیب لکتین نوع سی توکسوکارا کنیس تخلیص شده با این روش می تواند با اهداف مختلف مورد استفاده قرار گیرد.

کلیدواژه ها:

استخراج پروتئین ، توکسوکارا کنیس ، شرایط طبیعی ، شرایط واسرشته ، لکتین نوع سی