اولین گزارش از Diplodia malorum Fuckel عامل بیماری شانکر درختان سیب در ایران

در تابستان سال ۱۳۸۸ بیماری خشکیدگی شاخه و شانکر تنه درختان سیب (Malus domestica Borkh.) رقم گلدن در باغات استان آذربایجان غربی دیده شد. بیماری در اثر تنش های محیطی مثل خشک سالی و سرمازدگی گسترش یافته، پوست و سیستم آوندی درخت در محل آلودگی کاملا تیره می شود و محل شانکر در تنه اصلی و شاخه ها پوسته پوسته می گردد. جهت جداسازی، بافت های آلوده و مشکوک به بیماری به مدت ۳ دقیقه در اتانول ۷۰ درصد ضد عفونی سطحی گردیده و ۳ مرتبه با آب مقطر سترون شسته شدند. قطعات پس از خشک شدن بین کاغذ صافی سترون، روی محیط کشت PDA منتقل و در دمای ۲۵ درجه سلسیوس و تاریکی قرار داده شدند. از قارچ های رشد کرده در حاشیه بافت های گیاهی، قطعاتی برداشته شده و به محیط کشت آب آگار ۲ درصد منتقل و عمل خالص سازی به روش کشت نوک ریسه انجام گرفت. برای القای تشکیل اندام های باردهی غیر جنسی، از روش سوزن کاج قرار گرفته روی محیط کشت آب آگار ۲ درصد استفاده گردید. تشتک های مایه زنی شده به مدت ۴ هفته در دمای ۲۵ درجه سلسیوس و در زیر نور نزدیک ماورا بنفش (near-UV) و با دوره نوری ۱۲ ساعت روشنایی و ۱۲ ساعت تاریکی جهت تولید پیکنیدیوم ها نگهداری شدند (Pavlic et al. ۲۰۰۸). برای شناسایی قارچ های رشد یافته، معیارهای مختلف ماکروسکوپی از قبیل رنگ و خصوصیات ظاهری رشدی پرگنه و مشخصات میکروسکوپی از قبیل رنگ، شکل و ابعاد کنیدیوم، سلول های کنیدی زا و پیکنیدیوم مورد مطالعه قرار گرفتند. برای تایید شناسایی مورفولوژیک، بخش ITS در یکی از جدایه های منتخب، با استفاده از آغازگر های ITS۱ و NL-۴ تکثیر و ترادف یابی گردید. بر اساس مطالعات مورفولوژیک و ترادف یابی بخش ITS ، گونه Diplodia malorum شناسایی شد. مشخصات توصیفی گونه به شرح زیر است: بافت پرگنه در ابتدا سفید رنگ، ولی بعد از گذشت دو هفته به رنگ زیتونی نخودی تا زیتونی متمایل به سبز تغییر یافته و در نهایت بعد از سه هفته کاملا سیاه می شود. کنیدیوماتاها به صورت پیکنیدیومی، به قطر تقریبی ۶۰۰ × ۵۰۰ میکرومتر، به طور منفرد یا در دسته های چندتایی به شکل گرد تا تقریبا مخروطی، به رنگ قهوه ای تیره تا سیاه و فرورفته در بافت و در هنگام بلوغ کمی شکوفا می باشند. سلول های کنیدی زا بی رنگ، صاف، استوانه ای شکل، در قسمت پایه متورم و به ابعاد ۱۶- ۷ × ۵- ۵/۲ میکرومتر هستند. کنیدی زایی در یک سطح با قطور شدگی حاشیه ای (Priclinal) و یا به صورت percurrent و دارای ۲ یا ۳ حلقه می باشد. کنیدی ها با دیواره ضخیم، با سطح بیرونی صاف و سطح درونی زگیل دار، تقریبا بیضی کشیده تا استوانه ای، در هر دو انتها گرد، ابتدا بی رنگ و یک سلولی بوده و به مدت طولانی در داخل پیکنیدیوم بی رنگ باقی می مانند ولی بعد از خروج از پیکنیدیوم، به رنگ قهوه ای تیره تغییر می یابند و دارای یک دیواره عرضی (ندرتا ۲ دیواره عرضی) و به ابعاد ۱۶-۱۱ × ۳۴-۵/۱۹ میکرومتر می باشند (شکل ۱). جستجوی بلاست توالی به دست آمده با توالی های موجود در بانک ژن شباهت ۱۰۰ درصدی آن را با جدایه های گونه Diplodia malorum تایید نمود (Phillips et al. ۲۰۱۲). آزمون اثبات بیماری زایی، با تلقیح جدایه ها روی نهال های دو ساله و هم چنین میوه سیب رقم گلدن در قالب طرح کاملا تصادفی به همراه تیمار شاهد انجام گرفت. بعد از گذشت ۸ هفته، تمام نهال های تلقیح شده توسط جدایه های قارچی علائم شانکر، سیاه و خشک شدن پوست در اطراف محل تلقیح شده را نشان دادند، در صورتی که در تیمار شاهد، هیچ گونه سیاه شدگی و یا خشک شدن پوست مشاهده نگردید و بافت کالوز در اطراف زخم ناشی از برداشتن حلقه تشکیل و رشد عادی نهال ها ادامه یافت. در مورد میوه ها، مطالعات بیماری زایی نشان داد که بعد از گذشت ۶ روز، در اطراف محل تلقیح، علایم پوسیدگی قهوه ای تیره با حاشیه کاملا مشخص و متمایز از بافت سالم ایجاد شد و در برش عمودی از محل تلقیح، پیشرفت پوسیدگی به داخل میوه به طور مشخصی مشاهده گردید، در صورتی که در تیمار شاهد هیچ گونه علائم پوسیدگی یا تغییر رنگ ایجاد نگردید (شکل ۲). از بافت های تازه آلوده شده و دارای نشانه های سیاه شدگی پوست در نهال ها و میوه ها، بعد از عمل ضد عفونی سطحی، عمل جداسازی و شناسایی قارچ مجددا انجام گرفت و به این ترتیب اصول کخ اثبات شد. نتایج تجزیه واریانس آزمون اثبات بیماری زایی نشان داد که تمام جدایه های مورد مطالعه، روی نهال ها و میوه های سیب بیماری زا بوده و نسبت به تیمار شاهد تفاوت معنی داری نشان دادند. بر اساس بررسی منابع، این اولین گزارش از وجود و تعیین بیماری زایی گونه Diplodia malorum مرتبط با شانکر درختان سیب در ایران می باشد.