تکنیک PCR

PCR

به طور کلی PCRبه روش ازدیاد مقادیر جزییDNAیاRNA ،ازدیادRNAبا روشRT-PCR امکان پذیر است تا حد مشاهده ی آن ها توسط روش های ساده و ایجاد آزمایشگاهی اطلاق می شود.قابلیتPCRدر ازدیاد اسید نوکلئیک موجود درزمینه مورد آزمایش موجب شناسایی سریع واقتصادی نوع سلول یا میکروا رگانیسم مورد نظر درنمونه مذکور می گردد که این ویژگی علاوه بر به کارگیری PCRدرتشخیص آزمایشگاهی بیماری ها وشناسایی انواع سلول ها،آن را به عنوان ابزاری مطمئن وحساس در زمینه پژوهش های علمی مطرح می سازد.
اولین بار آقایی به نام کری موریس به این فکر افتاد که همانندسازی DNAرابه صورت مصنوعی در آزمایشگاه انجام دهد وبدین ترتیب روشPCRرا انجام داد.

اجزای لازم برایPCRاستاندارد. 

اجزای مخلوط واکنش:
/Taq دیگرپلیمرازهای مقاوم به حرارت
DNAالگو
پرایمرها
داکسی نوکلئوتیدتری فسفات ها(dNTPs)
MgCl2
پیپت خودکار/ظروف پلاستیکی/دستکش
دستگاه چرخه حرارتی(ترمال سایکلر)

مکانیسم PCR

همانطور که می دانیمDNAیک ملکول مارپیچی دورشته ای پلی نوکلئوتیدی است که این دو رشته در جهت مقابل هم قرار گرفته اندوبطورویژه ای به وسیله ی پیوند های هیدروژنی میان بازهای آلی مکمل یکدیگر متصل هستند(سیتوزین به وسیله ی سه پیوند هیدروژنی به گوانین وآدنین به وسیله دوپیوند هیدروژنی به تیمین اتصال پیدا می کند). DNAدورشته ای می تواند به وسیله حرارت ازهم جدا شده ودوملکول DNAتک رشته ای ایجاد کند.بطور کلی هر چرخه PCR شامل سه مرحله میباشد

مرحله ی تغییر ماهیت(Denaturation step)

در این مرحله مولکولهای دو رشته ای DNA بوسیله حرارت بالا ( حدود ۹۴ درجه سانتیگراد ) از همدیگر جدا گردیده و به مولکول های تک رشته ای تبدیل می شوندپرایمرها (اولیگونوکلئوتیدها ) به وسیله تکنیکهای شیمیایی به صورت سریع و ارزان ساخته می شوند . اولیگونوکلونیدهاوقتی که به DNA دناتوره شده افزوده می شوند به عنوان پرایمر برای DNA پلیمراز عمل نموده و اجازه می دهندتاDNA جدید در داخل آزمایشگاه سنتز شود و در PCR دو نوع پرایمرمورد استفاده قرار می گیرد که هر کدام از آن ها به محل های ویژه در دورشته ی مکمل ملکولDNA هدف پیوند می شوند پرایمرهای مذکور به صورتی ساخته شده اند که زمانیکه DNA پلیمراز یک پرایمر را توسعه میدهد یک مولکول DNA بوجود می آورد که آن DNA دارای یک محل اتصال جدید برای پرایمر دیگر میشود این رشته DNA جدید تولید شده نیز همینطور قادر خواهد بود به عنوان الگو ( template ) برای سنتر DNA از پرایمر دیگر در جریان چرخه های بعدی PCR عمل نماید .

مرحله اتصال(Annealing or Hybridization step)

در این مرحله کاهش دمای واکنش صورت میگیرد تا اینکه پرایمرها بتوانند به مولکولهای DNA تک رشته ای پیوند زده شوند . درجه حرارت مورد استفاده برای این مرحله می تواند از ۳۰درجه سانتیگراد تا ۷۲ درجه سانتیگراد متغیر باشد .

مرحله توسعه(Extension step)

دراین مرحله که آخرین مرحله یک چرخه PCR می باشد آنزیم Taq پلیمراز(کهDNAپلیمرازی است مقاوم حرارت و از یک باکتری ترموفیل به نام برمون آکواتیکوس Themis aquaticus استخراج میشود ) با استفاده از داکسی نوکلئوتید تری فسفات ها ، پرایمر را در روی DNA تک رشته ای امتداد می دهد تا DNA دو رشته ی جدید بسازد . درجه حرارت لازم برای این مرحله ۷۲درجه سانتیگراد میباشد که این درجه حرارت برای آنزیمهای مقاوم به حرارتی که به طور عادی مورد استفاده قرار می گیرند مناسب می باشد . هر چرخه PCR نهایتا با دو برابر شدن تعداد ترادفهای DNA هدف همراه است که تکرار چرخه بدفعات زیاد ۳۰ تا ۴۰ بار منجر به افزایش توالی در تعداد ترادفها DNA هدف و در نتیجه ازدیادDNA هدف به میزان یک میلیون برابر بیشتر خواهد شد.

از زمان اختراع PCR دو پیشرفت تکتیکی عمده به طور قابل توجهی PCR را اصلاح کرده است . اولین ، پیشرفت بکارگیری و ترویج پلیمرازهای مقاوم به حرارت همانند Tac پلیمراز بوده است که این آنزیم توانایی مقاومت در برابر مرحله تغییر ماهیت یا تقلیب یعنی حدود ۹۴ درجه سانتیگراد را دارد . این بدان معنی است که در حال حاضر میتوان بدون افزودن آنزیم پلیمر از تازه بعد از هر مرحله تغییر ماهیت( تقلیب به لوله های PCR آزمایشPCR را انجام داد . دومین پیشرفت عمده توسعه تجارتی بلوکهای حرارتی قابل برنامه ریزی میباشد که این بلوکها به ترمال سایکلرها ( Thermal cycler ) معروف هستند . استفاده از ترمال سایکتر در انجام PCR باعت حذف مرحله خسته کننده و وقت گیر انتقال لوله های PCR از یک بن ماری به یک بن ماری دیگر می شود ، زیرا این دستگاه که قبلا بوسیله خود آزمایش کننده تنظیم و برنامه ریزی شده است به طور اتوماتیک حرارت های لازم را برای مراحل سه گانه PCR تولید می نماید ضمن اینکه تعدادچرخه های مورد نیاز نیزبرای انجام PCR و ازدیاد DNA بطور اتوماتیک در این دستگاه قابل برنامه زیری می باشند .با دو پیشرفت فوق الذکر اکنون ما می توانیم تمامی اجزاء PCR عبارتند از بافرPCR، دو نوع پرایمر چهار نوع داکسی نوکلئوتید تری فسفات dATP,dTTP , dCTPو dGTP، آنزیم Taq پلیمراز و DNA الگو (که با روش های مختلف قابل استخراج میباشد) با همدیگر در لوله های پلی پروپیلن مخلوط و پس از افزودن یک قطره روغن معدنی بر سطح مخلوطها ، بدون حضور شخص آزمایش کننده لوله های PCR را به مدت چند ساعت در ترمال سایکلر برنامه ریزی شده از قبل قرار داد تا PCR انجام شود واکنشهای تکمیل شده بر روی ژل آگارز برده شده و سپس محصولات PCR یا به عبارت دیگر DNAهای ازدیاد یافته در روی ترانس ایلومیناتور قابل رویت می شوند.