همسانهسازی ژن FRY1 در وکتور بیانی pET

ژن FRY1 FIERY1 در گیاه آرابیدوپسیس یک ژن واکنشگر به تنشهای غیر زیستی بوده و آنزیم اینوزیتول فسفات- 1- فسفاتاز را کد میکند. از جمله نقشهای مهم آنزیم FRY1 تجزیهی پیامبر ثانویهی اینوزیتول 1 و 4 و 5 تری فسفات IP3 و تغییر درمیزان Ca+ 2 سیتوزول میباشد. از دیگر فعالیتهای آنزیم FRY1 میتوان به تجزیهی PAP که در فرایند خاموشی ژن در سلول نقش دارد اشاره نمود. لذا آنزیم FRY1 از اهمیت ویژهای در مطالعهی سیستم های پیامرسانی سلول برخوردار است. هدف از این تحقیق، همسانهسازی ژن FRY1 در سیستم بیانی pET به منظور بررسی فعالیت آنزیمی آن در شرایط invitro است. لذا از بافتهای رویشی گیاه آرابیدوپسیس RNA استخراج و پس از ساخت cDNA نسخهی cDNA ژن FRY1 ا پرایمرهای اختصاصی 5-GCTTGACATATGATGTCTATCAATTGTTTTCG-3' حاوی جایگاه برشی NdeI و -GCGGCCGCTCAGAGAGCTGAAGCTTTCTCTTG-3' 5 با جایگاه برشی NotI تکثیر شد. محصول PCR در وکتور pTG19-T وارد پلاسمید نوترکیب pTG19-T:FRY1 اقدام به برش آن با آنزیمهای NdeI و NotI و جداسازی FRY1 گردید. پس از خالصسازی نسخهی cDNA ژن FRY1 ز ژل آگارز، این قطعه در وکتور بیانی pET28a وارد گردید و به باکتری E.coli(DH5α انتقال داده شد. پس از همسانهسازی و استخراج پلاسمید نوترکیب pET28a:FRY1 به منظور تایید حضور نسخهی cDNA ژن FRY1 در سازهی ژنی فوق از 2 روش برش آنزیمی با استفاده از آنزیمهای BamHI و NdeI-NotI و توالییابی قطعهی مورد نظر استفاده شد. سپس سازهی نوترکیب pET28a:FRY1 جهت بیان مضاعف پروتئین FRY1 به باکتری BL21(DE3) انتقال یافت.