درج ژن پروتئین پوششی ویروس لکه حلقه ای بافت مرده درختان هسته دار در پلاسمید بیانی pET28

ویروس لکه حلقه ای بافت مرده درختان هسته دار Prunus necrotic ring spot virus, (PNRSV) در جنس Ilavirus و خانواده Bromoviridae قرار دارد و توسط دانه گرده و پیوند انتقال می یابد . ژنوم این ویروس آرانای تکرشتهای مثبت است. این ویروس ازجمله عوامل بیماری زای محدودکننده محصول در میوه کاریهای جهان است که موجب کاهش کیفی و کمی میوه ها شده و خسارت زیادی را همه ساله به میوه کاریهای جهان وارد میکند. هدف از این مطالعه تکثیر ژن پروتئین پوششی PNRSV و همسانه سازی آن در باکتری Escherichia coli به منظور تهیه سازه بیانی برای بیان پروتئین پوششی ویروس است. بدین منظور ابتدا ژن پروتئین پوششی یک جدایه مشخص (Zn3) PNRSV با استفاده از آغازگرهای طراحیشده دارای جایگاه برش با آنزیم-های مناسب Bam HI)و (Sac I جهت درج در قاب صحیح، در آزمون پیسیآر تکثیر شد. پس از تکثیر ژن پروتئین پوششی و خالصسازی آن، اتصال قطعه تکثیر یافته در مرحله اول با استفاده از T4 DNA Ligase درون پلاسمید همسانهسازی (pTG19) صورت گرفت. سازه ساختهشده (pTG19PNRSVCP) با روش شوک حرارتی درون سلولهای مستعد باکتری Escherichia coli سویه ی DH5α انتقال داده شد. به منظور اطمینان از صحت سازه pTG19-Zn3-PN در سلول مستعد، کلونهای رشد یافته در آزمون پی سی آر کلونی بررسی شدند. نتایج پیسیآر کلونی نشاندهنده درج صحیح ژن موردنظر درون پلاسیمد همسانه سازی بود. سپس استخراج پلاسمید از کلونهای رشد یافته درون محیط مایع انجام شد. نتایج توالی یابی حاکی از حفظ قاب خواندنی ژن موردنظر درون پلاسمید همسانه سازی بود. در مرحله بعد ژن موردنظر با آنزیمهای برشی مناسب با توجه به جایگاه های برش از پلاسیمد همسانه سازی خارج و درون پلاسمید بیان pET28 قرار گرفت تا به میزبان بیان E.coli BL21(DE3) انتقال داده شود.