بررسی مولکولی میکروارگانیسم های مزوفیل کیتینولاکتیک در کارگاه های پرورش میگو و خالص سازی نسبی آنزیم کیتیناز

هدف: کیتین ماده با ارزشی است که استفاده های صنعتی ، پزشکی ، آرایشی و بهداشتی دارد. منابع تولید کننده کیتین عبارتند از: میگو، خرچنگ ، لابستر، کریل ، صدف های دو کفه ای، ماهی مرکب ، مرجان های آب شیرین ، دیاتومه ، حشرات و قارچ ها. کیتیناز ها در میکروارگانیسم های حاوی کیتین ، باکتری ها و گیاهان با نقش های متفاوتی وجود دارند. در مکانیسم های دفاعی در پاسخ به پاتوژن ها و استرس ها و پارازیتیسم نقش ایفا می کند. از اهداف می توان به این موارد اشاره کرد. 1. تولید کیتیناز مزوفیل و بررسی خصوصیات مولکولی آن 2. خالص سازی نسبی کیتیناز حاصل ازمزارع پرورش میگو مواد و روش کار: جهت آنالیز SrRNA 16 پس از انجام مطالعات بیوانفورماتیک یک جفت پرایمر طراحی شد. استخراج DNA ،PCR و عمل recovery انجام گرفت و وارد پلاسمید pTZ57RlT گردید. پلاسمید وارد باکتری Ecoli و PCR کلونینگ انجام شد. تخلیص نسبی آنزیم : در دمای 4 درجه سانتی گراد آمونیوم سولفات به محلول کیتین در حال هم زده شدن اضافه می شود تا به 90% درجه اشباع برسد. به مدت یک شبانه روز در دمای 4 درجه سانتی گراد قرار گرفت و بعد سانتریفوژمی شود. رسوب حاصل در بافر استات، حل می شود. رسوب را دو مرتبه دیالیز شده تا بافر با نمک تعویض شود. نتایج و بحث : این آنزیم کاربرد عمده ای شیلات دارد. فعالیت ، پایداری و آماده سازی آنزیم به همراه قیمت آن فاکتورهای مهمی هستند که برای استفاده از کیتینازها باید مد نظر قرار داد. استفاده از پسماندهای پوسته میگو برای احیای کیتین و تولید آنزیم های کیتینولایتیک مورد استفاده قرار می گیرد. چون فراوان هستند و استفاده از آن ها آلودگی زیست محیطی و قیمت را پایین می آورند. پسماندهای پوسته میگو از کیتین ، پروتئین ، لیپید و مواد معدنی تشکیل شده اند. باکتری از لحاظ خصوصیات بیوشیمیایی مورد مطالعه قرار گرفت . سویه جدا شده به عنوان یک باکتری متعلق به جنس انتروباکتردسته بندی شد. ولی برای رسم دقیق درختچه فیلوژنتیکی باکتری اقدام به استفاده از آنالیز SrRNA 16 شد. پس از انتخاب قطعه ژنی و پرایمر های مورد نظر، به وسیله نرم افزارهای مولکولی DNASIS,BLAST, oligo خصوصیات آن ها مورد بررسی قرار گرفت . تخلیص نسبی با استفاده از رسوب دهی با آمونیوم سولفات صورت می پذیرد. الکتروفورز SDS-PAGE با استفاده از ژل اکریل آمید 12% در شرایط احیایی و بر اساس روش Laemmli انجام می شود و باندهای پروتئینی با رنگ آمیزی با نیترات نقره ظاهرمی شوند

کلیدواژه ها:

خالص سازی نسبی ، کیتیناز ، ، میکروارگانیسم مزوفیل ، SrRNA 16