اندازه گیری همزمان 25 - هیدروکسی کوله کلسیفرول و 25 -هیدروکسی ارگوکلسیفرول به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

مقدمه و هدف: با توجه به شیوع بالای درجات مختلف کمبود ویتامین D در ایران، ارزیابی صحیح وض عیت این ویتامین برایمقاصد بالینی، پژوهشی و بهداشتی اهمیت به سزایی دارد . غلظت سرمی 25 -هیدروکسی OH)D)D) 25)، به عنوان نماگر معتبر وضعیت ویتامین D پذیرفته شده است . سنجشهای مبتنی بر کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، روش های استاندار اندازه گیری 25(OH)D به شمار می آیند . هدف از انجام این مطالعه راه اندازی یک روش معتبر و نسبتاً ساده مبتنی بر HPLC برای اندازه گیری غلظت سرمی 25(OH)D با به کار گیری آشکارساز فرابنفش بود.روش کار: پروتئینهای سرم با استفاده از اتانل و سپس آمیزه متانل : ایزوپروپانل ( 90:10 ، حجمی) رسوب داده و سپس 25- هیدروکسی کلسیفرول به کمک فاز آلی هگزان، استخراج شد . هگزان تحت گاز ازت تبخیر و رسوب حاصله در متانل حل شد و پس از فیلتراسیون،نهایتاً 20μL از محلول صاف شده به ستون Teknochroma tracer excel 150×4, 3μm تزریق و کروماتوگرافی با فاز متحرک متانل: آب ( 85:15 ، حجمی ) حاوی 0/01 درصد BHT و دمای ستون 40˚C انجام شد. این روش قادر به شناسایی افتراقی (25(OH)D(3 در طول موج 265nm بود . نتایج حاصل از آزمایش 90 نمونه سرم انسانی با این روش، با نتایج دو روش رایج پرتو-ایمنی سنجی (RIA) و واکنش رقابتی پیوند به پروتئین (CPBA) مقایسه گردید. درجه همخوانی نتایج این سه روش با استفاده از تعیین ضریب همبستگی و آنالیز بلند-آلتمن ارزیابی شد. نتایج: زمان بازداری برای 25(OH)D3 تا غلظت 375nmol/L و برای (25(OH)D(2 تا غلظت 175/5nmol/L خطی بود. حد آشکار سازی برای هر دو ویتامر 12/5nmol/L بود. درصد بازیافت برای (25(OH)D(3 و (25(OH)D(2 در آزمایش های متعدد به ترتیب 5/6±101% و 5/4±100/8% به دست آمد . تغییرات درون و میان سنج شی برای (25(OH)D(3 به ترتیب 8/1% و 12/6% بود دو روش RIA و CPBA نتایج بالاتری نسبت به HPLC به دست دادند (p=0/02). روش RIA در مقایسه با CPBA همخوانی بیشتری را با HPLC نشان داد. نتیجه نهایی: روش HPLC معرفی شده در این مطالعه برای اندازه گیری سطوح سرمی 25(OH)D، روشی است قابل اعتماد و نسبتاً سریع با این مزیت که توانایی شناسایی افتراقی (25(OH)D(2 و (25(OH)D(3 را نیز دارد.تزریق و کروماتوگرافی

کلیدواژه ها:

پرتوایمنی سنجی ، سنجش رقابتی پیوند به پروتئین ، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا ، ویتامین د