جداسازی ژن عامل رونویسی از خانواده (NACs(At3G12910 از آرابیدوپسیس (Arabidopsis thaliana) ساخت At3G12910-pER8 و انتقال آن به اگروباکتریوم

نمو برگ یکی از عوال تأثیر گذار در فتوسنتز و ماده ساز توسط این اندام است که نه تنها بستگی به اثر متقابل آن با سایر اندامها دارد، بلکه تحت تأثیر تنشهای مختلف زنده و غیرزنده نیز می باشد. پیری برگ نقش بسیار مهمی در توزیع مجدد مواد مغذی در گیاه در خلال رشد زایشی دارد. مهمترین عامل تنظیم کننده رشد و نمو برگ، همچون سایر اندامها، تنظیم بیان ژنهای مرتبط است. مهمترین عوامل تنظیمی پروتئینهایی موسوم به عوامل رونویسی هستند. تعدادی از عوامل رونویسی مؤثر در پیری برگ شناسایی شده اند. این ژنها به طور عمده در گروهی موسوم به خانواده NAC ها قرار می گیرند. عوامل رونویسی این خانواده بیشتر با ژنهای مرتبط با پیری و فرآیندهای رشد و نمو در پاسخ به تنشها در بسیاری از گیاهان زراعی در ارتباط هستند. (ORE1(ANAC092 یکی از اعضای این خانواده است که مشخص شده نقشی کلیدی در پیری دارد. بر اساس اطلاعات بیوانفورماتیکی به نظر می آید که یکی از اعضای دیگر این خانواده با شناسه At3G12910 در بالادست ORE1 قرار گرفته است. هدف از اجرای این تحقیق تهیه سازه القایی شامل ژن At3G12910 درون ناقل القایی pER8 است که تحت تأثیر حضور استرادیول منجر به افزایش قابل توجه بیان این ژن می شود. بدین صورت امکان شناسایی ژنها و شبکه تنظیمی پائین دستی این عامل رونویسی فراهم می شود. برای این منظور ابتدا از RNA از اندام مختلف گیاه آرابیدوپسیس استخراج و cDNA ساخته شد. سپس PCR با استفاده از آغازگرهای رفت و برگشت اختصاصی شامل سایتهای برشی مناسب و cDNA اندام مختلف به عنوان الگو استفاده شد که ژن At3G12910 با استفاده از cDNA برگ بالغ به عنوان الگو تکثیر شد و سپس در ناقل حدواسط pJET همسانه سازی شد. پس از یافتن و تأئید کلون مناسب با هضم آنزیمی و توالی یابی، ناقل pJET واجد ژن و ناقل pER8 هر دو با آنزیمهای XhoI و SpeI برش داده شدند و پس از تخلیص قطعات و غلظت سنجی اتصال ژن با استفاده از T4DNAligase انجام شد. سپس محصول اتصال طی فرآیند تراریزش به روش شوک حرارتی به سلولهای مستعد E.coli سویه DH5α انتقال داده شد. سپس با استخراج پلاسمید از کلونهای مثبت رشد کرده در محیط کشت انتخابی هضم آنزیمی تأئیدی و توالی یابی انجام شد. سپس ناقل pER8 واجد ژن به سلولهای مستعد Agrobacterium tumefaciens سویه GV3101 به روش شک الکتریکی بازترازیزش شد. در نهایت کلونهای مقاوم توسط کلونی PCR تأئید شد.

کلیدواژه ها:

، At3G12910 ، خانواده عوامل رونویسی NAC ، پیری ، ناقل pER8