شناسایی بررسی بیان برخی از microRNAهای حفاظت شده دخیل در مسیر بیوسنتز ویتانولیدها در پنیرباد (Withania somnifera)

  • سال انتشار: 1402
  • محل انتشار: مجله علمی تحقیقات ژنتیک و اصلاح گیاهان مرتعی و جنگلی ایران، دوره: 31، شماره: 1
  • کد COI اختصاصی: JR_IJRFP-31-1_010
  • زبان مقاله: فارسی
  • تعداد مشاهده: 134
دانلود فایل این مقاله

نویسندگان

محمد رضا نقوی

دانشگاه تهران

سعادت محمد نژاد

Dept. Agriculture and Plant Breeding, Faculty of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran

نفیسه خسروی

Alborz Medical University

جابر نصیری

Nuclear Agriculture Research School, Nuclear Science and Technology Research Institute

چکیده

سابقه و هدف: پنیرباد (Withania somnifera) متعلق به خانواده سیب زمینی، به صورت یک درختچه کوچک همیشه سبز با ریشه­های غده­ای بزرگ است و در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری وجود دارد. ترکیبات اصلی پنیرباد، ویتانولیدها هستند که شامل ویتافرینA، ویتانولیدD، ویتانولیدA و ویتانون­ها می باشند. ویتافرین A و ویتانون­ها بیشتر در برگ­های پنیرباد وجود دارند، در حالی که ویتانولید  Aعمدتا در ریشه تولید می­شود. بیوسنتز این متابولیت ها به ژن­های فارنسیل پیروفسفات (FPP)، سیکلوآرتنول­سنتاز (CAS)، استرول­متیل ترانسفراز (SMT۱) و هیدروکسی متیل گلوتاریل کوآنزیم A ردوکتاز (HMGR)، مرتبط با مسیرهای متابولیک مربوط بستگی دارد و RNAهای غیرکدکننده مانند miRNA­ها در تنظیم  بیان این ژن­ها و آنزیم­ها نقش دارند. ژن­های miRNA­ها، RNAهای کوچک با طول ۱۸- ۲۴ نوکلئوتید هستند که هیچ پروتئینی کد نمی­کنند و بروز ژن را در گیاهان و حیوانات تنظیم می­کنند. این گروه از RNAهای غیر­رمز کننده نقش مهمی در تنظیم بیان ژن پس از رونویسی ایفا می­کنند و به عنوان تنظیم کننده­های منفی بیان ژن در یوکاریوت­ها فعالیت دارند. این تحقیق با هدف شناسایی و بررسی بیان برخی miRNA های حفاظت شده دخیل در بیوسنتز ویتانولیدها در گیاه پنیرباد اجرا گردید.مواد و روش ها: در این پژوهش، برای انجام آنالیز HPLC از دستگاه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا متصل به آشکارساز ELSD، مدل C-۶۵۰ استفاده شد. به منظور شناسایی miRNA های حفاظت شده در گیاه پنیرباد از داده­های  RNA-seqمبتنی بر همولوژی توسط نرم افزار C-mii از BLASTn با معیارهای تا چهار عدم تطابق وE- value < ۱۰  استفاده شد. ساختار ثانویه miRNAهای متمایز به وسیله نرم افزار Mfold تعیین شد. ژن های هدف miRNAهای نامزد با استفاده از psRNATarget بر اساس پارامترهای زیر شامل: E-value < ۱.۰E-۵، تعداد جایگاه­­های مورد هدف برابر۲، محدوده نداشتن بازهای مرکزی بین ۱۰-۱۱ نوکلئوتید، بیشترین عدم تشابه برابر ۲ و بدون هیچ گونه فاصله انتخاب گردیدند و برای پی بردن به عملکرد ژن­های هدف از ابزارBLASTx  علیه پایگاه داده پروتئینی استفاده شد. در مرحله گلدهی نمونه برداری از دو بافت برگ و ریشه سه ژنوتیپ W۱ (۷۶۲۹۲۴۵)،W۳  (۷۶۲۹۲۴۱) و W۴ (۷۶۲۹۲۴۴) با سه تکرار تکنیکی و سه تکرار بیولوژیکی انجام گردید. از Real-time PCR برای ارزیابی بیان miRNA۵۰۲۱ و ژن هدف آن SMT۱ و miRNA۵۱۴۰ استفاده شد و تجزیه داده­های حاصل از بیان با استفاده از روش  CTΔΔ -۲ انجام شد.  یافته ها: با توجه به تجزیه های آماری داده­های حاصل از HPLC، بین مقدار ویتافرین­آ در سه ژنوتیپ (W۱، W۳ و W ۴) از لحاظ آماری اختلاف معنی داری مشاهده نشد. در بین بافت­های مورد مطالعه بیشترین میزان مربوط به برگ W۳ و کمترین به ریشه W۱ اختصاص داده شده است. برای شناسایی miRNAها ساختار دوم توالی­ها با سرور mfold پیش­بینی شد. حداقل انرژی آزاد پیچش (MFE) از ۱۵- تا ۴/۱۳۰- kcal.mol متفاوت بود و میانگین آن ۹۸/۴۲- kcal.mol محاسبه گردید. نتایج حاصل از روش RT-qPCR نشان داد که میزان بیان نسبی miR۵۰۲۱ در ریشه W۱، W۳ و W۴ نسبت به شاهد (بافت برگ W۱)، ۱۶/۱، ۳۷/۱ و ۱۷/۱ به ترتیب افزایش بیان و در برگ W۳ و W۴ به ترتیب ۱/۳ و ۷/۳ برابر کاهش بیان مشاهده شد. الگوی بیان برای ژن SMT۱ در سه ژنوتیپ W. somnifera برای ریشه W۱،  W۳و W۴ به ترتیب ۷/۷، ۸/۲ و ۴ برابر کاهش و در برگ W۳ و W۴ به ترتیب ۴۸/۲ و ۸۲/۱ برابر افزایش بیان نسبت به  شاهد مشاهده شد. همچنین بیان نسبی miR۵۱۴۰ در برگ W۳، ۵۷/۱ و برای W۴ بدون تغییر و در ریشه,WI  W۳ و  W۴نسبت به شاهد به ترتیب هفت، نه و سه برابر کاهش بیان دیده شد که طبق انالیزهای آماری برای miRNA۵۰۲۱ و miRNA۵۱۴۰ در بین  سه ژنوتیپ­ برای هر یک از این ژن­ها اختلاف معنی داری وجود ندارد.نتیجه­ گیری: در مجموع با توجه به نقش تنظیمی miRNAهای شناسایی شده در این مطالعه، می­توان از این ژن­ها در شناسایی بهتر و دقیق­تر مسیر بیوسنتز ویتانولیدها استفاده کرد.

کلیدواژه ها

miRNA, Transcriptome, Target gene, withaferin A

اطلاعات بیشتر در مورد COI

COI مخفف عبارت CIVILICA Object Identifier به معنی شناسه سیویلیکا برای اسناد است. COI کدی است که مطابق محل انتشار، به مقالات کنفرانسها و ژورنالهای داخل کشور به هنگام نمایه سازی بر روی پایگاه استنادی سیویلیکا اختصاص می یابد.

کد COI به مفهوم کد ملی اسناد نمایه شده در سیویلیکا است و کدی یکتا و ثابت است و به همین دلیل همواره قابلیت استناد و پیگیری دارد.