کلونینگ و شناسایی ژنGRA۴ توکسوپلاسما گونده ای سویه RH در پلاسمید یوکاریوت بیانی pcDNA۳

مقدمه و هدف: توکسوپلاسموزیس به وسیله یک انگل تک یاخته داخل سلولی (توکسوپلاسما گونده ای) ایجاد می شود و در سراسر جهان گسترش دارد. این بیماری دارای اهمیت عمده پزشکی و دامپزشکی است و عامل بیماری مادرزادی در انسان و حیوانات اهلی است. علاوه بر این، به تازگی به دلیل آنسفالیت در افراد ایدزی به اهمیت آن افزوده شده است. به همین دلیل تهیه یک واکسن موثر علیه توکسوپلاسما یک هدف مهم در جهان است. آنتی ژن گرانولی ۴ (GRA۴) به عنوان یک آنتی ژن عمده توکسوپلاسما گونده ای شناخته شده است. از این رو، به عنوان یک کاندیدا برای تهیه واکسن ملاحظه شده است. آنتی ژن گرانولی ۴ از برادی زوئیت ها و تاکی زوئیت ها ترشح می شود. این ژن به صورت کپی تک و فاقد اینترون است. هدف از این تحقیق، تهیه پلاسمید نوترکیب حاوی ژن GRA۴ است که بتوان از آن به عنوان DNA واکسن استفاده کرد. مواد و روش کار: در این تحقیق ژن GRA۴ پس از تکثیر به روش PCR در پلاسمید pTZ۵۷R کلون شد. سپس در باکتری اشرشیاکلی سوش TG۱ ترانسفورم شد. پلاسمید نوترکیب پس از تکثیر از باکتری میزبان استخراج و ژن هدف با استفاده از برش آنزیمی، با آنزیم های KpnI و EcoRI از پلاسمید pTZ۵۷Rجدا شد. از طرف دیگر پلاسمید pcDNA۳ برای پذیرش قطعه GRA۴ و انجام کلونینگ نیز با آنزیم های KpnI و EcoRI برش داده شد. GRA۴ درون پلاسمید pcDNA۳ ساب کلون شد و این محصول واکنش اتصال در باکتری های فوق ترانسفورم شده و در محیط LB حاوی آمپی سیلین کشت داده شدند؛ پلاسمیدهای نوترکیب pcGRA۴ به وسیله کیت استخراج پلاسمید، از اشرشیاکلی تخلیص شدند. نتایج: صحت کار با روش های PCR و برش آنزیمی به کمک آنزیم های اختصاصی فوق با استفاده از الکتروفورز تایید شده و نتایج نشان داد، قطعه GRA۴ در پلاسمید pcDNA۳ کلون شده است و باند حدود ۱۰۵۸ جفت بازروی ژل آگاروز ایجاد شده بود که هم اندازه ژن GRA۴ توکسوپلاسما گونده ای است و تایید نهایی با استفاده از توالی یابی انجام شد. نتیجه گیری: نتایج حاصل نشان داد، کلونینگ و ترانسفورم قطعه GRA۴ در پلاسمید pcDNA۳ با موفقیت انجام شده است.

کلیدواژه ها:

توکسوپلاسما گونده ای ، کلونینگ ، GRA۴ ، pcDNA۳