بررسی ایمنی زایی لنفوسیت های ب موشی علیه آنتی ژن RhD گلبول قرمز با ترکیب همزمان دو روش in vivo وin vitro

پس از آنتی ژن های سیستم ABO ، مهم ترین آنتی ژن گروه خونی در ایجاد عوارض جانبی ناشی از انتقال خون، RhD می باشد که از خاصیت ایمونوژنسیته بسیار بالایی در القای پاسخ های آلوایمنی در افراد دریافت کننده خون ناسازگار برخوردار است.[۲ ,۱] یکی از روش استاندارد جهت تعیین فنوتایپ گروه های خونی، روش های ایمونوهماتولوژیک با استفاده از آنتی بادی های منوکلونال اختصاصی ضد آنتی ژن می باشد.[۳]جهت تولید آنتی باد ی مونوکلونال دو مرحله ی اساسی وجود دارد که شامل ایمونیزاسیون و سپس نامیراسازی لنفوسیت های B به منظور دستیابی به یک کلون مناسب تولید کننده ی آنتی بادی می باشد. ایمونیزاسیون به روش های مختلفی انجام می شود . یکی از این روش ها ، ایمونیزاس یون در محیط کشت ( in vitro immunization) است.[۴] روش دیگر تزریق آنتی ژن به حیوان آزمایشگاهی و سپس درآوردن طحال و جداسازی سلول های تولید کننده ی آنتی بادی و سپس فیوژ کردن آن با یک سلول میلومایی می باشد.[۵]از مهمترین مزای ای ایمونیزاسیون در محیط کشت، تولی د آنتی باد ی از کلاس IgM می باشد که به علت ایجاد آگلوتیناس یون مستقیم گلبول های قرمز در دمای اتاق و در زمان کوتاه تر استفاده آن در تست های هماگلوتیناسیون در اولویت می باشد . این در حالی است که آنتی بادی های تولید شده در حیوان، غالبا از کلاس IgG می باشند. همچنین در این روش نیاز به استفاده کمتر از آنتی ژن جهت ایمنی زایی در مقایسه با میزان مورد نیاز آنتی ژن جهت تزریق به حیوان می باشد.[۴]از طرف دیگر، در ایمن سازی حیوان آزمایشگاهی ، به علت اینکه تولید و بلوغ سلول های تولید کننده آنتی بادی در محیط in vivo اتفاق می افتد امکان ایجاد سلول های تولید کننده آنتی بادی هایی با اختصاصیت بالاتر ضد آنتی ژن وجود دارد. با این وجود پس از تزریق ایمنوژن ،همه مراحل بعدی وابسته به شرایط فیزیولوژیک حیوان بوده و امکان کنترل فرایند ها در ادامه وجود ندارد.[۶] با توجه به مزایا و محدودیت های روش های ایمنوزاسیون in vivo و in vitroیکی از استراتژی های موثر ،می تواند تر کیب کردن این دو روش باشد.هدف در این مطالعه ، ایمن سازی لنفوسیت های B موشی به صورت ترکیبی از شرایط in vivo و in vitro جهت ایجاد سلول های تولید کننده آنتی بادی بر علیه آنتی ژن RhD و مطالعه کارایی آنتی بادی های تولید شده در شناسا یی این آنتی ژن با روش الایزا مورد بررسی قرار گرفت.روش تحقیق موش Balb c با سن حدود ۲ ماه تهیه شده و پس از بیهوش کردن ، طحال آن خارج گردید. طحال در آزمایشگاه به پتری دیش حاوی محیط RPMI ۱۶۰۰ حاوی %۲۰سرم جنین گاوی و %۲ پنیسیلین-استرپتومایسین منتقل گردید. جهت انجام in vitro immunization سلول های لنفوسیتی موجود در طحال ، آنتی ژن محلول RhD با غلظت ng/ml ۵۰۰ با سرنگ انسولین به بافت طحال تزریق گردید. سپس طحال در انکوباتور حاوی co۲ %۵ و در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۴ روز انکوبه شد. روز پنجم بافت طحال از انکوباتور خارج و با سرنگ حاوی محیط RPMI جهت خارج نمودن لنفوسیت های B چند بار در زیر هود شستشو داده شده و سپس لنفوسیت ها به چاهک های پلیت ۲۴ حفره منتقل گردیدند.در مرحله بعد به منظور بررسی ایمنی زایی لنفوسیت های حیوانی از روش الایزا استفاده شد. سوپ حاصل از سلول های طحالی به پلیت های کوت شده الا یزا به صورت تکرار سه تایی اضافه شد. از چاهک های فاقد آنتی ژن (non-coated) به عنوان کنترل منفیتست ( کنترل منفی (۱ استفاده شد. همچنین به عنوان کنترل منفی ثانویه، به برخی از چاهک های کوت شده نیز تنها محیط کشت سلولی (کنترل منفی (۲ اضافه گردید. در نهایت پلیت نمونه ها به دستگاه االیزا ریدر منتقل شد و در طول موج ۴۵۰ نانومتر میزان جذب نوری آنها سنجیده و نتیجه خوانده شد.نتیجه گیری نتایج تست الایزا نشان داد که تزریق آنتی ژن RhD در محیط in vitro به بافت طحال موش که در آن سلول ها در محیطمشابه in vivo قرار دارند ، باعث ایمنی زایی لنفوسیت های B موجود در طحال و تولید آنتی بادی ضد آنتی ژن تحریکی می گردد.

کلیدواژه ها:

ایمنی زایی ، آنتی ژنRhD ، لنفوسیتB ، in vivo ، in vitro