ردیابی دو ویروس موزاییک معمولی لوبیا و موزاییک نکروتیک معمولی لوبیا با استفاده از روش Immunocapture RT-PCR

عوامل ویروسی متعددی باعث بروز علایم موزا ییک و ایجاد خسارت در گیاه لوبیا چیتی ( Phaseolus vulgaris L.) میشوند. در بین این ویروسها ویروس موزا ییک معمولی لوبیا BCMV و ویروس موزا ییک نکروتیک لوبیا BCMNV از اهمیت ویژه ای برخوردار هستند . هدف: به منظور ردیابی دو ویروس BCMV و BCMNV از مناطق کشت لوبیا، در یک فصل زراعی نمونه هایی با علایم موزا ییک ، رگبرگ روشنی ، برگشتگی ، نکروتیک برگ و ساقه لوبیا جمع آوری گردید. روش ها: .در ابتدا نمونه ها با روشهای سرولوژیک DAS-ELISA و لکه گذاری بافتی ( Tissue-blot ) با آنتیسرمهای چند همسانه ای اختصاصی مورد سنجش و ردیابی قرار گرفتند. سپس جهت بررسی دقیق تر ، نمونه های آلوده با آزمون IC-RT-PCR مورد ارزیابی قرار گرفتند. در این آزمون ابتدا آنتی سرم اختصاصی ویروس های مورد نظر در بافر پوششی به نسبت 1:250 رقیق و در لوله های 0/ 5 میلی لیتری ریخته شد. این لوله ها به مدت 3 ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد نگهداری گردید. سپس محتویات لوله ها تخلیه و لوله ها با بافر ( PBS-T ) شستشو داده شدند. در مرحله بعد برگ گیاهان آلوده با استفاده از بافر عصاره گیری به نسبت 1:10 (وزنی به حجمی) عصاره گیری شدند و 200 میکرولیتر از این عصاره ها به لوله ها اضافه گردید. لوله ها به مدت یک شب در یخچال نگهداری شدند. سپس مطابق مرحله قبل شسته و خشک شدند. پس از این مرحله مواد لازم برای ساخت cDNA به آنها اضافه شد. به منظور انجام واکنش RT-PCR دو جفت پرایمر اختصاصی برای منطقه ای از ژن پروتئین پوششی به کار گرفته شد که این پرایمر ها در BCMV قطعه ای به اندازه bp 373 و در BCMNV قطعه ای به اندازه bp 683 را تکثیر میکنند.این واکنش با کمک دستگاه ترموسایکلر با برنامه دمایی 3min 94.c و 35 چرخه شامل 72c70s ، 55c90s، 94c70s ، و در پایان در 72c10min ،صورت گرفت. یافته ها :محصول حاصل در ژل آگاروز 1 درصد الکتروفورز شد. بر اساس مقایسه سایز باند های ایجاد شده ، جدایه های ویروسی از لوبیای آلوده در مناطق اراک ، نیشابور ، زنجان ، کرج تفکیک گردید. بحث و نتیجه گیری: روش IC-RT-PCR نسبت به روش RT-PCR آسان تر و کم هزینه تر و دقیق تر است. در روش معمولی RT-PCR ابتدا بایستی RNA ویروس جداسازی شود و چون RNA پایداری کمتری نسبت به DNA دارد به راحتی توسط RNase از بین می رود.

کلیدواژه ها:

سرولوژی IC-RT-PCR لوبیا